高效液相色谱法测定黑茶中咖啡因含量分析

□ 黄燚娜 东莞捷荣食品有限公司

茶作为一种传统饮品，长期饮用有非常好的降血脂、减肥效果，由此得到关注。相关研究表明，茶叶之所以有减肥功效，是其中包括活性成分，即茶多酚、咖啡因，进入到人体内会形成协同作用，加速机体代谢，从而达到减肥的效果。尤其是黑茶，黑茶中有500余种化合物，补充人体所需元素，例如维生素、蛋白质、氨基酸等，有极高的营养价值。但是，若服用过量的咖啡因，也会对人体的中枢神经系统形成刺激，出现中枢神经系统兴奋现象，甚至会中毒。为此，本文主要使用高效液相色谱法测定黑茶中所含有的咖啡因含量，以此来更好地认知黑茶。

1 试验试剂与仪器

1.1 材料与试剂

本次试验需要用到黑茶样品、咖啡因标准品、甲醇、乙醇、分析纯、二甲基甲酰胺以及二次蒸馏水。

1.2 仪器

试验所需仪器包括液相色谱仪、超声波清洗器以及Kromasil C18的色谱柱。

2 试验过程

组织试验主要有以下三个环节。

2.1 处理样品

首先，使用粉碎机将选定的黑茶样品进行粉碎处理，并且用筛子过滤，将大于0.45 mm的黑茶剔除。称量黑茶样品1.0 g，将其放到烧杯内，随后加入0.5 g的MgO与30 mL的二次蒸馏水，烧杯放在沸水浴内浸提，时间为20分钟，期间需要间隔5分钟进行一次振荡[1]。20分钟结束之后要马上将溶液进行减压过滤，待其冷却到室温之后，转移至50 mL的容量瓶内，以二次蒸馏水进行定容处理。定容至50 mL之后需要从中移取10 mL，将其进行超声脱气处理，时间为5分钟，使用混纤维孔滤膜进行过滤，将最后5 mL保留，准备测定。

2.2 制备咖啡因标样溶液

称量17 mg的咖啡因样品，将其放置在容量为50 mL的烧杯内，将甲醇和水按照70∶30的比例混合后放置在烧杯内将咖啡因样品溶解，从而完成咖啡因标样溶液配制。

2.3 色谱设置

本次试验选择的色谱柱为Kromasil C18，随后便可以设置流动相，即水-甲醇-乙酸-二甲基酰胺，其配置比例为70∶30∶0.05∶0.25。色谱柱温设置为25 ℃，检测器选用紫外检测器，检测和扫描波长分别为274 nm、210～400 nm。

3 试验结果

3.1 样品中咖啡因含量检测

对本次试验所有样品进行检测，基于设置的色谱条件保证每种样品进样次数为3次，以此计算积分峰面积平均数值以及所有样品中所含有的咖啡因含量，最后结果如下：茯茶中含有7.295 mg/g咖啡因，新生普洱茶中含有19.92 mg/g咖啡因，新熟普洱茶含有28.0575 mg/g咖啡因，沱茶含有18.725 mg/g咖啡因。

将已经制备好的咖啡因标样溶液放置在10 mL的容量瓶内，溶液分别取0.5、0.9、1.3 mL，再以甲醇和水将溶液进行定容。超声脱气处理5分钟，随后使用混纤维滤膜进行溶液过滤[2]。确定进样量，即5 μm，积分峰面积和咖啡因质量浓度分别当作横坐标与纵坐标，通过试验所得数据绘制标准曲线，并确定标准曲线的回归方程，即Y=6×10-8X+0.0044。

3.2 样品精密度检测

试验过程中需要称取1.0 g的样品，并且对样品进行处理，将其制备成4个质量浓度溶液，各个浓度的溶液分别进行多次检测，以最终结果为精密度计算依据[3]。本次试验精密度检测结果如下：① 样品质量浓度是0.018 mg/mL，测定值在0.015 86～0.016 82 mg/mL，检测平均值是0.016 53 mg/mL，标准偏差是0.000 66 mg/mL，变异系数为3.98%；② 样品质量浓度是0.033 mg/mL，测定值在0.029 62～0.030 28 mg/mL之间，检测平均值是0.030 55 mg/mL，标准偏差是0.001 2 mg/mL，变异系数为3.68%；③ 样品质量浓度是0.048 mg/mL，测定值在0.043 62～0.044 51 mg/mL，检测平均值是0.043 96 mg/mL， 标 准偏 差 是0.000 69 mg/mL，变异系数为1.66%；④ 样品质量浓度是0.055 mg/mL，测定值在0.053 91～0.056 86 mg/mL，检测平均值是0.055 46 mg/mL，标准偏差是0.000 61 mg/mL，变异系数为0.61%。

3.3 咖啡因样品回收率

完成以上试验之后，依然要称取1.0 g的咖啡因样品，并进行样品制备与处理，将其配制成3种浓度的溶液，并且加入1.0 mL的咖啡因标准品溶液，随后均匀混合，进行超声脱气处理，利用混合纤维膜处理之后开始进样检测。检测最终显示回收率在91.25%～104.4%[4]。

4 结论

首先，在黑茶内所含咖啡因提取溶剂的试验过程中，主要是对黑茶水泡与咖啡因二者可溶于乙醇这一特点进行观察，将黑茶与水、浓度分别为50%、70%以及90%的乙醇溶液混合，将超声时间设置为30分钟，计算咖啡因样品的峰面积。试验显示，浓度为50%的乙醇溶液当中黑茶内含有的咖啡因含量比较大，所以咖啡因含量测定试验建议选择浓度为50%的乙醇溶液当作提取溶剂。

其次，需要选择合适的检测波长，以此为色谱分析奠定基础。相关研究表明咖啡因检测波长存在很大差异，所以试验高效液色谱二极管阵列检测器作为试验器具，明确最为合适的检测波长。试验过程中，二极管阵列检测器中的波长扫描范围将其设置在190～400 nm，将已经完成配制的溶液注入针孔注射器中，通过0.45 μm滤头进行过滤，随后开始波长扫描。尽管201.7 nm 位置的吸收值相对来说比较大，但是因为一些物质中含有末端吸收，所以该波长的咖啡因色谱峰便会受到杂质峰影响，尽管271 nm的吸收值小，然而却有非常大的专属性，不会造成干扰，所以可以将其作为咖啡因特征吸收峰。由此，建议确定271 nm为检测波长。

最后，测定黑茶内的咖啡因含量会受诸多因素影响，例如：黑茶的品种以及制作条件等，所以每个地区的黑茶所含有的咖啡因也不尽相同。对比黑茶发现，每个品种的黑茶含有的咖啡因不同，为此可以采集更多的样本，对其中的咖啡因含量进行测定。

通过分析可知，此次试验所使用的高效液相色谱法在黑茶内咖啡因含量的测定中，最终结果准确性高，且操作过程灵活、简便，还体现出极强的专属性，适合用于黑茶中咖啡因含量定量测定。