丁苯酞在血管性认知功能障碍中的作用及研究进展

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血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment，VCI)为各种原因引起缺血缺氧所致的从血管性轻度认知功能障碍(vascular mild cognitive impairment，VMCI)到最严重的类型血管性痴呆(vascular demntia，VaD)的临床综合征[1]。其病变主要累及皮质及海马等关键部位，表现为学习、记忆能力、定向力、判断力等认知功能方面的损害。近些年来，在对脑血管疾病的研究过程中，神经血管单元已被人们逐渐重视，其主要由神经元、血管内皮细胞和星形胶质细胞组成。其中血管内皮细胞对脑组织的新陈代谢和血流动力学发挥了重要的作用。脑组织对缺血缺氧损害敏感，可导致血管内皮细胞为主的神经血管单元受到损伤，可引起脑血管功能失调、血脑屏障的破坏、氧自由基的大量产生、线粒体功能障碍、神经元内钙离子超载及炎症反应等，最终致使神经元凋亡和坏死，导致痴呆和运动障碍等症状。据悉，在西方国家中VaD在所有痴呆病人中约占15%，而在发展中国家VaD所占比例高达30%[2]。目前，世界上诸多国家已步入老龄化社会，且这一阶段会持续很长时间；同时，近年来各类脑血管病发生率及其危险因素增加迅速。两者致使VaD患病率越来越高，为病人家庭和社会带来了巨大的经济和人力负担。VaD作为唯一可防可治的痴呆，目前已进行了大量研究，以期在早期阶段(VMCI阶段)逆转这一疾病，提高病人的生活质量，减轻家庭和社会负担。L-3-正丁基苯酞(L-3-n-butylphthalide，L-NBP)早先提取于芹菜种子，具有神经保护作用。基于此物，我国科学家自主研发了dl-3-正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，dl-NBP或NBP)，即含D-和L-异构体的化合物。2002年，我国食品药品监督管理总局正式批准NBP作为治疗急性缺血性脑卒中的新型临床药物[3]。经过多年的研究，发现NBP可在多种神经系统疾病中发挥神经保护作用。如NBP可通过减少小胶质细胞活化延长肌萎缩性侧索硬化症动物模型的寿命[4]；NBP可保护帕金森病动物模型的多巴胺能神经元[5]；NBP可通过促进神经可塑性改善中风大鼠模型症状[6]。此外，还发现NBP可改善痴呆病人认知功能。本研究对NBP潜在机制和途径进行总结，为今后NBP在临床应用中提供明确、可靠的依据。

1 NBP的抗氧化作用

大脑具有巨大的能量需求，因此脑细胞胞质中线粒体发达。在线粒体的能量代谢中，可产生大量氧自由基。但是大脑组织和细胞却少有抗氧化系统，因此大脑较其他器官极易受氧自由基的损伤。氧化应激过程可产生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，对脑组织造成损害，与脑缺血互为因果关系，可导致与认知功能相关的蛋白质降解、脂质与DNA氧化损伤，因此，氧化应激是VaD的主要发病机制之一[7]。

Li等[8]于2009年在体外实验中证实了NBP可通过减轻氧化应激反应、维持线粒体结构和功能稳定以保护血管内皮细胞耐受缺血缺氧的损害。此项研究提示NBP可能对包含VCI在内的脑血管疾病有着抗氧化、保护线粒体等重要作用。同时，发现NBP亦可提高缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α)的表达。HIF-1α为缺氧诱导基因表达的关键调节因子，具有促进无氧酵解、血管生成、神经元及神经干细胞生存生长等重要生理作用[9]，提示NBP通过改变能量代谢途径、改善血液循环、维持神经元存活等途径促使脑组织对抗缺血缺氧损害。Zhang等[10]通过VaD动物实验研究表明，NBP可改善VaD大鼠空间学习、记忆能力；并在体外细胞实验中发现NBP可减少氧化应激引起的细胞凋亡，更为NBP在临床中进一步应用提供了理论依据。

近年来，有研究显示NBP可增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的水平，经增强过氧化物酶的活性对抗氧化应激的损害[11]。另一项研究表明NBP 可通过调控氧化应激相关蛋白NADPH 氧化酶(NADPH oxidase，NOX)的表达，使ROS 的产生减少，降低机体氧化能力，进一步降低氧化应激对脑组织的损伤[12]。同时，还发现NBP可通过激活AKT/Nrf2信号通路。AKT即为蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/AKT)，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一个控制严格、高度保守的多级联信号通路。Nrf2(NF-E2-related factor 2)属于 Cap‘n’ collar 家族一个重要的转录因子，可在基因水平上调控氧化应激，为机体最重要的抗氧化调节因子。研究显示AKT磷酸化后可激活Nrf2，增强多种抗氧化酶的表达，启动机体氧化防御机制，从而减少神经元凋亡，发挥神经保护作用[12]。由此，可以得知氧化应激在VCI的发生发展中起着重要作用，而NBP可以通过多种途径有效地拮抗氧化应激过程，清除ROS，保护神经元，改善VCI认知障碍等症状。

2 NBP抑制炎症反应作用

脑缺血缺氧损伤可引起多种炎症介质产生增加[13]，诱导星形胶质细胞和小胶质细胞的激活[14]，进一步破坏血脑屏障、损害细胞功能等，直接或间接对神经元造成损害。因此，炎症反应是VaD重要病理机制之一，有效地限制脑受损区域炎症反应，可减轻脑组织的损害。

有研究显示，脑缺血缺氧损伤后可引起大鼠模型海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量增多，并可能与VaD发生发展密切相关[15]。毛西京等[16]研究发现NBP可显著抑制VaD大鼠海马组织中TNF-α的过度表达，降低其对大脑的损害从而发挥神经保护作用；但研究表明NBP降低海马组织中IL-1β的水平。在临床治疗过程中，发现急性缺血性脑卒中病人血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和血清同型半胱氨酸(HCY)较正常人显著增高；在进行NBP治疗后，发现其可明显降低急性缺血性脑卒中病人蒙特利尔认知评估量表(MoCA)和简易精神状态检查量表(MMSE)评分，同时降低血清hs-CRP和HCY浓度，改善病人记忆、命名、注意力及语言功能等[17]。同时，有研究显示NBP可抑制小胶质细胞的活化[18]、星形胶质细胞活化[19]，从而发挥神经保护作用。因此，NBP具有抗炎症作用。

3 NBP改善血流动力作用

在动物实验过程中，经常对大鼠双侧颈总动脉进行永久性结扎制备慢性脑缺血或VaD模型。在造模成功后，发现大鼠皮质及海马等区域血供明显减少，若不做干预其血流可在至少术后3周才能恢复，而在此期间大鼠大脑血供减少区域均发生病理改变，认知功能也随之下降[20]。

Xiong等[19]研究发现，NBP可于早期阶段通过增加椎动脉直径和促进血管生成改善皮质及海马等区域的血供，并在术后第2周将血流恢复至正常。Zhang等[10]发现在受损脑区域血管周围血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体VEGF2、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)表达增多，提示NBP可能促进血管增生，改善血液循环。Li等[21]曾对双侧大脑中动脉永久性闭塞大鼠模型进行NBP干预，亦发现在海马及梗死外周带等区域VEGF、bFGF及其mRNA表达增多，提示NBP可从基因表达上调控两者表达致使血管增生，改善海马等区域的血液循环，对血管性痴呆症状具有改善作用。贾朝均等[22]对脑小血管病病人进行NBP干预，治疗后对各组病人进行认知功能评定和脑CT灌注扫描分析，结果显示NBP可改善脑血管疾病所致认知功能障碍，增加脑缺血区域血流灌注。

此外，2001年的一项动物研究表明NBP具有抗血小板聚集和血栓形成的作用，可能是通过升高血小板内环磷酸腺苷(cAMP)实现的[17]。2015年，Ye等[23]进行了NBP对人类血小板的作用机制探讨，表明NBP可通过抑制血栓烷A2(TXA2)和磷酸二酯酶(PDE)而降低血小板活性、防止血小板聚集。一项多中心、双盲临床试验中证实NBP在治疗急性缺血性卒中比奥扎格雷和阿司匹林更安全、更有效[24]。

4 NBP抗细胞凋亡作用

脑组织在受到各种损害因素条件下，可启动各种凋亡通路诱导神经元凋亡。在一项关于心脏骤停的动物试验中，观察到NBP可保护海马神经元耐受缺血缺氧的损害[25]。Xiong等[19]在对大鼠造模、药物干预之后，进行NeuN抗体和Caspase-3蛋白抗体检测，证实NBP可有效保护慢性脑缺血大鼠海马神经元，减少其凋亡。

2010年有研究于体外与体内实验中再次证实NBP可减少脑缺血所致的细胞凋亡，明显减小脑梗死面积；同时表明NBP可下调c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)与P38蛋白表达[26]。JNK与P38同属丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族，皆为应激激活蛋白激酶，可接受细胞外刺激，调控基因表达、细胞分化及有丝分裂、细胞凋亡等生理过程[27]。ROS、营养因素缺乏等多种细胞内外刺激性因素均可激活JNK和P38，而JNK 的激活可进一步引起细胞色素C(cytochrome C，cyto C )的释放与半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶(Caspase)的激活进而启动细胞凋亡过程[28]；P38经一系列生化过程，亦可激活Caspase-3等途径启动细胞凋亡程序[29]。Caspase通路是介导细胞凋亡的重要物质，在细胞凋亡中起着关键的作用；Caspase-9是此家族中的凋亡启动子，而Caspase-3为细胞凋亡过程中的效应蛋白[30]。脑缺血时，可引起cyto C由线粒体释放进入胞质中，后引起Caspase家族一系列级联反应，这一过程是启动凋亡过程的关键步骤。cyto C进入胞质后，可与Apaf-1结合并形成Apaf-1-cyto C复合体，再与Caspase-9前体互相作用形成凋亡体，在ATP刺激下激活Caspase-9前体，进一步激活Caspase-3促进细胞凋亡。而这项研究也发现了NBP可阻止cyto C从线粒体释放到胞质中，同时抑制Caspase-9、Caspase-3的激活。因此，NBP可能通过抑制JNK-cyto C-Caspase-9-Caspase-3和P38-Caspase-3两条依赖Caspase的细胞凋亡途径。除此之外，上述研究显示NBP可在体内与体外试验中抑制凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)从线粒体释放到细胞质中[26]。近年来，经研究得知凋亡诱导因子介导不依赖Caspase通路的另一条凋亡通路[31]。曾有临床研究对细胞内注射AIF后发现，AIF可使细胞核DNA部分丢失、大片断裂，染色体向周边凝集[32]。因此，NBP可能也通过抑制AIF介导的这一不依赖Caspase的细胞凋亡途径而发挥抗细胞凋亡作用。

NBP由我国自主研发，对急性缺血性脑卒中和VCI有治疗作用。这为全世界缺血性中风和痴呆病人做出了卓越的贡献。NBP对VCI的作用机制涉及抗氧化应激、抗炎症反应、改善血流动力学及抗细胞凋亡等多个方面。同时，发现NBP对帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑水肿及脊髓损伤等神经系统疾病具有一定的疗效。

参考文献：

[1] Gorelick PB,Scuteri A,Black SE,et al.Vascular contributions to cognitive impairment and dementia[J].Stroke,2011,42(9):2672-2713.

[2] Kalaria RN,Maestre GE,Arizaga R,et al.Alzheimer's disease and vascular dementia in developing countries:prevalence,management,and risk factors[J].The Lancet Neurology,2008,7(9):812-826.

[3] Abdoulaye IA,Guo YJ.A review of recent advances in neuroprotective potential of 3-n-butylphthalide and its derivatives[J]. Biomed Res Int,2016,2016:1-9.

[4] Feng X,Peng Y,Liu M,et al.DL-3-n-butylphthalide extends survival by attenuating glial activation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J].Neuropharmacology,2012,62(2):1004-1010.

[5] Xiong N,Huang J,Chen C,et al.Dl-3-n-butylphthalide,a natural antioxidant,protects dopamine neurons in rotenone models for Parkinson's disease[J].Neurobiology of Aging,2012,33(8):1777-1791.

[6] Sun Y,Cheng X,Wang H,et al.dl-3-n-butylphthalide promotes neuroplasticity and motor recovery in stroke rats[J].Behavioural Brain Research,2017,329:67-74.

[7] Bell RD,Zlokovic BV.Neurovascular mechanisms and blood-brain barrier disorder in Alzheimer's disease[J].Acta Neuropathologica,2009,118(1):103-113.

[8] Li L,Zhang B,Tao Y,et al.DL-3-n-butylphthalide protects endothelial cells against oxidative/nitrosative stress,mitochondrial damage and subsequent cell death after oxygen glucose deprivation in vitro[J].Brain Research,2009,1290:91-101.

[9] Semenza GL.Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor 1[J].Physiology,2009,24(2):97-106.

[10] Zhang L,Lü L,Chan WM,et al.Effects of DL-3-n-butylphthalide on vascular dementia and angiogenesis[J].Neurochemical Research,2012,37(5):911-919.

[11] 刘倩,冯友繁,葛力.丁苯酞治疗血管性痴呆的临床疗效及其对氧化应激反应的影响[J].实用心脑肺血管病杂志,2017,25(4):146-148.

[12] 齐倩倩.丁苯酞对血管性痴呆大鼠认知功能的影响及Akt/Nrf2信号通路和NOX1蛋白的调节作用[D].石家庄:河北医科大学,2016.

[13] Calabrese V,Giordano J,Signorile A,et al.Major pathogenic mechanisms in vascular dementia:roles of cellular stress response and hormesis in neuroprotection[J].Journal of Neuroscience Research,2016,94(12):1588-1603.

[14] Thameem Dheen S,Kaur C,Ling EA.Microglial activation and its implications in the brain diseases[J].Current Medicinal Chemistry,2007,14(11):1189-1197.

[15] Li Y,Zhang Z,Zhao J,et al.Influences of Bushen Xingnao Decoction on expression of vascular endothelial growth factor,IL-1β and tumor necrosis factor-α in vascular dementia rats[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,28(6 Suppl):2317.

[16] 毛西京,罗翔丹,于挺敏,等.丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马组织TNF-α和IL-1β表达的影响[J].中国医药导报,2017,14(3):12-15.

[17] Xu HL,Feng YP.Effects of 3-n-butylphthalide on thrombosis formation and platelet function in rats[J]. Acta Pharmaceutica Sinica,2001,36(5):329-333.

[18] 姚娟,高小平.丁苯酞对Wistar大鼠血管性痴呆模型中海马区OX-42的影响[J].湖南师范大学学报(医学版),2016,13(5):133-137.

[19] Xiong Z,Lu W,Zhu L,et al.Dl-3-n-butylphthalide treatment enhances hemodynamics and ameliorates memory deficits in rats with chronic cerebral hypoperfusion[J].Frontiers in Aging Neuroscience,2017,9:238.

[20] Jing Z,Shi C,Zhu L,et al.Chronic cerebral hypoperfusion induces vascular plasticity and hemodynamics but also neuronal degeneration and cognitive impairment[J].Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism,2015,35(8):1249-1259.

[21] Li QF,Kong SY,Deji QZ,et al.Effects of dl-3-n-butylphthalide on expression of VEGF and bFGF in rat brain with permanent focal cerebral ischemia[J].Journal of Sichuan University Medical Science Edition,2008,39(1):84-88.

[22] 贾朝均,罗丽君,余巨明,等.丁苯酞对脑小血管病患者血流灌注及认知功能影响的临床研究[J].中华临床医师杂志(电子版),2016,40(14):2072-2077.

[23] Ye J,Zhai L,Zhang S,et al.dl-3-n-butylphthalide inhibits platelet activation via inhibition of cPLA2-mediated TXA2synthesis and phosphodiesterase[J].Platelets,2015,26(8):736-744.

[24] Cui LY,Zhu YC,Gao S,et al.Ninety-day administration of dl-3-n-butylphthalide for acute ischemic stroke:a randomized,double-blind trial[J].Chinese Medical Journal,2013,126(18):3405-3410.

[25] Zhang L,Puchowicz MA,LaManna JC,et al.Protective effect of Dl-3-n-Butylphthalide on recovery from cardiac arrest and resuscitation in rats[M].Springer International Publishing,2016:31-36.

[26] Li J,Li Y,Ogle M,et al.DL-3-n-butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway[J].Brain Research,2010,1359:216-226.

[27] Kuida K,Boucher DM.Functions of MAP kinases:insights from gene-targeting studies[J].Journal of Biochemistry,2004,135(6):653-656.

[28] Davis RJ.Signal transduction by the JNK group of MAP kinases[J].Cell,2000,103(2):239-252.

[29] Duarte S,Shen XD,Fondevila C,et al.Fibronectin-α4β1interactions in hepatic cold ischemia and reperfusion Injury:regulation of MMP-9 and MT1-MMP via the p38 MAPK pathway[J].American Journal of Transplantation,2012,12(10):2689-2699.

[30] de la Cadena SG,Massieu L.Caspases and their role in inflammation and ischemic neuronal death.Focus on caspase-12[J].Apoptosis,2016,21(7):763-777.

[31] Plesnila N,Zhu C,Culmsee C,et al.Nuclear translocation of apoptosis-inducing factor after focal cerebral ischemia[J].Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism,2004,24(4):458-466.

[32] Cao G,Clark RSB,Pei W,et al.Translocation of apoptosis-inducing factor in vulnerable neurons after transient cerebral ischemia and in neuronal cultures after oxygen-glucose deprivation[J].Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism,2003,23(10):1137-1150.