线栓法制作大鼠大脑中动脉梗死模型的体会与造模失败原因分析

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大鼠因其成本低、脑内血管解剖特性与人类相似等诸多特点，至今仍是研究脑缺血疾病最常用的动物。制作动物脑梗死模型的方法有很多种，其中大脑中动脉梗死(MCAO)线栓法模型因不开颅、易于操作而被广泛应用。大鼠MCAO模型是目前公认的研究脑梗死、脑缺血的经典模型，为研究脑缺血再灌注的机制及评估其治疗方案的疗效提供了可靠验证平台[1]。近年研究发现，短暂性脑缺血对神经细胞起保护作用，可抵御其后发生的严重脑缺血，减轻缺血组织的病变程度，即诱发了脑缺血耐受(IT)[2]。脑缺血耐受是指给予短暂的亚致死性缺血后诱导的脑内源性保护机制，从而对后续长时间缺血损伤产生耐受及自身保护作用。建立脑缺血耐受的模型为进一步研究脑缺血对脑梗死神经保护作用的机制有重要意义。本研究旨在阐述在造模过程中的心得体会，并对造模过程中可能导致造模失败的原因进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物与器材 实验动物：SPF级成年雄性SD大鼠60只，体重250 g～280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，由湖南中医药大学实验动物中心提供。实验器材：动脉夹，常规手术器械，显微手术器械，碘伏，75%乙醇，眼科剪，生理盐水，标志笔，3号、5号外科缝合丝线，10%水合氯醛，线身直径0.26 mm，线头直径(0.36±0.02)mm，线长40 mm，头端包被有多聚赖氨酸栓线(购自北京西浓科技有限公司，型号2636-100，A4级别)。

1.2 MCAO模型制作 大鼠适应性喂养2 d～3 d。采用线栓法经左侧颈内动脉插入栓线制作大鼠MCAO模型。以10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔给药麻醉后，固定于鼠板上，消毒颈前皮肤，参照文献方法制作大鼠MCAO模型：备皮后沿颈部正中偏左侧做切口，分离皮肤与浅筋膜，逐步暴露颈动脉鞘，钝性分离颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)及颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，结扎 ECA 及 CCA 近心端，在两个结扎端之间的CCA剪一小口，将栓线经CCA插向ICA，调整栓线走向，直至将栓线插入至规定部位。术后伤口消毒、皮肤缝合。

1.3 观察指标 神经功能缺损评分：造模后2 h进行神经功能评分，采用Longa评分标准[3]，0分：无神经功能缺损症状，可正常活动；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：行走时向对侧转圈追尾；3分：行走时身体向对侧倾倒；4分：不能自主行走，意识丧失。0分和4分者剔除，1分～3分为造模成功。

1.4 实验结果 造模时死亡15只，造模失败10只，造模成功35只(12 h内死亡4只、24 h后死亡5只，3 d后死亡4只，5 d时死亡4只)。

2 体 会

2.1 关于实验动物的选择 选用何种品系大鼠制作模型，取决于研究者的实验条件和技术。目前经典的动物是 Wistar 大鼠和 SD 大鼠。雌激素能扩张血管，增加脑血流量，减轻脑实质损伤，具有明显的神经元保护作用[4]，可降低大鼠脑梗死的发生率和死亡率，因此，最好选择雄性大鼠作为实验对象，且以 250 g～280 g的雄性大鼠最佳。避免选用老龄大鼠，老龄大鼠脑动脉扭曲或管腔狭窄使线栓难以推进，且其抵抗力、耐受性均较差，选用壮年大鼠制备模型，成功率较高。

2.2 关于麻醉剂的选择 国外研究者制备MCAO模型采用步骤繁琐且价格昂贵的氟烷诱导麻醉。国内学者多用2%戊巴比妥钠(0.10 mL/100 g)或10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)进行腹腔麻醉。对体重相同的大鼠进行麻醉，戊巴比妥钠所用剂量较水合氯醛小，其麻醉剂量与致死量接近，易引起大鼠死亡；另外戊巴比妥钠可使脑内温度下降明显[3]，能够减轻脑组织损伤，影响造模效果。故而选用10%水合氯醛作麻醉剂，其给药浓度应控制在0.40 mL/100 g，浓度过高，容易麻醉过深，产生呼吸抑制，甚至死亡。

2.3 关于造模时手术操作 目前绝大多数研究者采用大鼠颈前正中切口。本实验采用颈部外侧切口[5]，方便钝性分离肌肉，较好暴露手术视野，分离血管，同时避免对气管造成机械刺激，减少对迷走神经的刺激。结扎血管、动脉夹夹闭 ICA 时，需远离颈动脉窦及迷走神经节，防止大鼠猝死。在结扎准备完毕之后再用血管夹夹闭 ICA，缩短刺激血管及迷走神经的时间。插线时保留适当长度线头在血管外，用于充当牵引线，保证线栓进入血管后成功向颅内推进，操作中适当调整血管及线栓进入角度，可提高插入成功率。

2.4 关于线栓选择及插入深度 线栓制备方法直接关系到模型制备成功率。Longa等是将线栓头端融成球形[6]，Koizumi等是在线栓头端涂以硅树脂，而Belayev等则是先加热使线栓头端变钝，然后涂以多聚赖氨酸溶液。国内研究者的处理方法也都不尽相同[7]。本实验选用头端包被有多聚赖氨酸栓线，以提高模型的稳定性。体重与MCA的粗细在一定范围内存在正相关性，但大鼠体重超过400 g时，这种相关性明显降低[8]。栓线过粗，易插破ICA或难以入颅；栓线过细，插入血管内留有间隙不能完全阻塞血管，达不到梗死效果[9]。直径大于0.3 mm的线栓在进入 ICA 和经 ICA入颅时易插破血管导致出血，导致造模失败或动物死亡。而直径为 0.28 mm时，模型制作成功率高、重复性好、对动物血管影响较小。因此对于体重 250 g～280 g 的大鼠，线栓的最佳直径为 0.25 mm～0.28 mm。当栓线插入深度为1.0 cm～1.5 cm时，大鼠未出现明显神经功能缺损；栓线插入深度为1.8 cm～2.2 cm时，出现明显的神经功能缺损症状，而插入深度超过2.2 cm时，大鼠极易昏迷不醒，造模后24 h内死亡率高达37.33%。故而建议线栓插入深度以2.0 cm左右为最佳。

3 造模失败原因分析

3.1 术中出血过多 造模过程中出血过多：包括分离颈部血管时出血、血管破裂出血、血管夹闭不全出血、线栓头脱落出血、反复多次插入线栓出血等。可能原因：①实验造模时用眼科剪在 CCA剪开一斜形开口，在插入鱼线时被剪开部分容易被拽断，同时血管原有的生理形态扭曲改变，难以将线栓送入颅内，即便勉强将线栓送入，也因血管断开、出血过多，不能保证线栓插入的深度，导致造模成功率下降，死亡率增高。②不熟悉大鼠解剖结构，造模时间较长，线栓插入不顺，反复推送不能进入规定位置，使得血管塌陷，难以区分颈动脉鞘及血管，线栓多次刺激血管壁，甚至刺穿血管壁，致使造模过程中出血量增多，引起大鼠死亡。

3.2 术前及术中、术后可能存在的原因 ①造模前24 h未予禁食，大鼠体内过高的血糖水平可能增加术后脑梗死面积[10]；进食影响体重使得水合氯醛给药总量过多造成死亡。②水合氯醛配制时间太久，没有进行避光保存，使得给药剂量偏差加大。水合氯醛不稳定，久置、光照、高温等条件均可促进其分解，用其进行腹腔麻醉，需现配现用，否则给药剂量过大引起大鼠麻醉过深，呼吸道分泌物增多，若合并分离血管时损伤迷走神经，则更易导致大鼠窒息死亡，所以术中必须精确麻醉，小心操作。③动物苏醒后出现状态不佳，不欲进食、进水、甚至出现腹泻、精神萎靡等症状，造模后24 h内死亡率极高，原因可能是水合氯醛麻醉过量，对胃肠道造成一定影响，加之腹泻脱水、术中失血过多，导致低血容量休克死亡。④腹腔麻醉时麻醉药注射入肠腔造成麻醉不足及术后肠梗阻。腹腔注射时注意将针头向外回抽。⑤造模、麻醉期间、造模后没有注意保温，导致低体温及亚低温损伤增加了大鼠死亡率[11]。⑥手术时间过长，手术部位大量体液不显性挥发、术中失血，术后未予以及时补液，导致体液丢失严重，影响造模成功。⑦手术过程中没有严格执行无菌操作，术前、术后预防感染不及时。应在术后手术缝合部位撒少量青霉素粉剂，也可术前予以腹腔注射青霉素G 20×104U～30×104U(溶于1 mL～2 mL生理盐水中)预防感染。

3.3 其他可能原因 ①术中血栓形成：线栓插入损伤血管内皮，可能导致血栓形成，堵塞重要血管，阻碍线栓插入，栓线方向应尽量与血管走行方向保持一致；②线栓头端不平整光滑、插线用力过猛或反复多次调整栓线角度，使得线栓进入蛛网膜，形成蛛网膜下隙出血；③造模时间过长，使得线栓在阻断MCA时，同时影响下丘脑体温调节中枢循环，导致脑缺血后高温，影响造模结果的可靠性。

4 结 语

MCAO模型是研究脑梗死疾病的基础[1，12]，虽然其造模方法仍在不断的改进，但线栓法制备MCAO模型以其可重复性强、造模成功率高等优点，仍为多数研究者首选的经典造模方法。线栓法制备MCAO模型的环节众多，故而影响造模成功的因素颇多，每一步都应重视。造模前需考虑存在的各种干扰因素，积极寻找应对措施，提高造模成功率，尽可能制备出最大程度接近于人类脑梗死的MCAO模型，为研究人类脑梗死的发病机制和验证临床治疗手段发挥更大的作用。总之，在制备大鼠MCAO模型过程中，处理好实验动物的选择，线栓的制备，线栓插入深度和插入方法，麻醉剂的选择，手术操作手法，术前、术中、术后合理干预等步骤，保证并提高模型的成功率，使实验差异性进一步减小。另外，线栓法制备MCAO模型还存在许多不足，需不断改进完善，实验中可以不断地解决问题、摸索创新，确保模型的成功。

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