自噬在肝癌中的双面性作用及自噬调节剂用于肝癌治疗的研究进展

单钰莹 陆才德

自噬是一种分解代谢过程，当机体营养缺乏时，其在发育、分化、体内平衡和细胞存活中起关键作用[1]。自噬常被饥饿、蛋白质聚集和其他形式的应激（如氧化应激和内质网应激）诱导[2]，而后出现巨噬细胞或细胞内膜性结构包裹细胞质的一部分，形成双膜囊泡，通常称之为自噬小体[1]。自噬小体随后与溶酶体融合，在成熟过程中被溶酶体蛋白酶降解。除了保持细胞内代谢的稳态外，自噬参与多种肿瘤疾病的发生[3]。有研究表明，自噬在肝脏疾病发生、发展中发挥关键作用，自噬失调与病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、肝硬化和肝细胞癌（HCC）均相关[2，4]。本文分别从自噬对HCC的正向与反向两方面作用，介绍自噬在HCC发生、发展中所起的作用，以及自噬相关试剂对HCC的影响研究综述如下。

1 自噬抑制HCC

有研究表明，在肝脏中自噬起到抑癌作用，抑制自噬可促HCC的发展；Beclin-1杂合性破坏的小鼠模型中检测到细胞增殖增加和自噬减少，癌前病变的发展受到促进，发生恶性肿瘤的概率增加；缺少编码Beclin-1调节蛋白（称为AMBRA1）基因的一个拷贝的小鼠也发现肿瘤进展[5]。这种肿瘤发生的主要原因可能是由于退化的线粒体和/或过氧化物酶体的活性氧簇（ROS）会增加基因组不稳定性，最终导致自发性肿瘤形成。最近研究发现，在肝癌前期，Atg5基因的沉默会引起自噬的缺失进而促进枯否细胞产生炎性因子和纤维因子；巨噬细胞缺乏自噬反应时会引起NF-κB信号通路强化及IL-1α/β表达增加，进而促进线粒体ROS介导的炎症和纤维化，最终促进肿瘤发生、发展；反之，阻断线粒体ROS或IL-1受体均会阻止由Atg5基因敲除引起的纤维化、炎症和肿瘤形成[6]。

SQSTM1也是自噬过程中的重要因子，在癌旁组织中检测不到，但在HCC肿瘤组织中表达[7]。在人类HCC细胞中，已经发现了磷酸化SQSTM1和KEAP1的阳性聚集结构，其表达受NRF2调节，过表达与磷酸化会使KEAP1失活，从而形成正反馈环加速NRF2的活化[8]，进而可以靶向延迟HCC细胞的生长[9]。持续感染HBV或HCV的HCC细胞中可检测到自噬体受损，SQSTM1磷酸化与NRF2激活。mTORC1可直接参与SQSTM1的磷酸化，因此可作为此通路中NRF2激活的限速关键因子[9]，从而负向调节自噬[10]。有研究发现，小鼠HCC前体细胞中的SQSTM1过表达通过活化mTORC1和NRF2来驱动HCC发生[11]。PI3K-AKT-mTORC1信号通路中促癌基因的突变（如TSC1、TSC2和PTEN）也可调节自噬，肝特异性PTEN或TSC1基因敲除的小鼠发生HCC也与SQSTM1介导的NRF2激活相关[12]。HCC发生时通常NRF2或KEAP1存在体细胞突变，这种突变通常导致NRF2的持续激活，帮助肿瘤细胞抵抗氧化损伤和自噬，因此这两种基因都被认为是癌症驱动因素[13]。上述机制表明SQSTM1-KEAP1-NRF2轴有助于肿瘤生长。除此之外，NRF2还可将葡萄糖和谷氨酰胺重新定向为有利于肿瘤细胞生长的合成代谢途径（包括戊糖磷酸途径、嘌呤核苷酸合成、谷胱甘肽合成和谷氨酸分解），这种代谢重组也可促进HCC发生、发展[11]。另有研究发现，SQSTM1 蛋白还可通过 NF-κB、Wnt/β-连环蛋白等多种信号通路促进HCC形成[14]。

上述研究均为自噬抑制HCC学说提供了相关证据。从机制方面分析，可能的原因为：自噬缺乏导致错误折叠的蛋白质合成，失调的线粒体聚积，活性氧产生和氧化应激的发生，导致DNA损伤增加和双链DNA断裂积累，细胞转化阶段的染色体不稳定，进而促进癌症发生。

2 自噬促进HCC

近年来，越来越多的学者发现自噬可促进HCC发生、发展。由于部分细胞发生自噬后可向其余存活癌细胞提供氨基酸、脂肪酸和生存所需的能量，因此这种细胞降解作用可以支持癌细胞增殖，这种作用在缺血、缺氧等恶劣条件下可帮助肿瘤细胞存活[15]。研究发现，为维持其快速增殖，癌细胞在进展和转移时需要丰富的营养和氧供，生长因子被剥夺的动物细胞需要通过自噬维持细胞的存活[16]。

自噬反应增多与HCC的肿瘤进展和预后不良均相关[17]。在非小细胞肺癌小鼠模型中，自噬的缺失可抑制KRAS对肿瘤发生的驱动作用[18]。胰腺癌小鼠模型中自噬可阻断p53的激活，从而促进RAS诱导癌细胞生长[19]。在HCC中也存在类似研究，肝特异性ATG5敲除小鼠可以诱导p53等多种抑癌因子，在p53缺乏的野生型小鼠中敲除ATG5可诱使HCC转为良性肝腺瘤[20]。鞘氨醇激酶1（SPHK1）可诱导TNF受体相关因子2（TRAF2）介导的巨噬细胞/自噬活化，加速CDH1/E-钙黏蛋白溶酶体降解并诱导上皮 -间质转化（EMT），从而促进肝癌细胞的侵袭和转移[21]。有证据表明，50%～60%的肿瘤在缺氧条件下表现出自噬反应增多[22]。另一项研究发现，合并乙型肝炎时，肝癌细胞中ATG5和ATG12 mRNA的表达明显升高，且肿瘤组织较癌旁组织中ATG5-ATG12蛋白表达水平升高。同时该项研究还发现自噬激活时，肝癌细胞系感染HBV后再敲除ATG12基因，肝癌细胞凋亡百分比增加11.4%，但同样处理普通肝癌细胞系时凋亡比无明显改变。因此，也许ATG12是一针对HBV-HCC的靶向因子[23]。AKT/PI3K通路为肿瘤中作用范围较广的一条通路，AKT抑制剂1/2（AKTi-1/2）可诱导细胞发生保护性自噬，自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤、氯化铵和巴弗洛霉素A1）处理或Beclin-1 siRNA敲除可抑制自噬的发生并显著增强AKTi-1/2诱导的HepG2细胞死亡和细胞凋亡；研究结果表明自噬反应是HCC细胞中AKTi-1/2的主要抗性因子[24]。

3 自噬抑制剂治疗HCC

由于自噬可维持细胞内稳态，癌细胞也需要自噬来对抗应激从而保证细胞的存活，这种对抗作用对HCC药物也有一定影响。自噬抑制剂可以阻止自噬的促肿瘤生存效应，与抗HCC药物联用时可增强细胞毒性。高浓度的溶酶体抑制剂巴弗洛霉素(BafA1）对多种癌症均显示出细胞毒性。BafA1在G1期诱导细胞周期阻滞，并加速LC3转化，促进p62/SQSTM1表达，抑制溶酶体降解，从而阻断自噬流，进而诱导HCC细胞死亡。因此，BafA1或许可以成为HCC的治疗手段之一[25]。现已有抗癌药物和自噬抑制剂如氯喹（CQ）和羟氯喹（HCQ）联用治疗各类癌症的临床试验[26]。实验发现，CQ和HCQ可通过沉淀质子来增加溶酶体的pH从而阻止酸性溶酶体降解，即阻止自噬的最后阶段[27]。据报道，多种化疗药物及靶向药物均会诱导肝癌细胞发生保护性自噬，从而增加耐药，但联用自噬抑制剂可以增强奥沙利铂、顺铂、5-氟尿嘧啶和索拉非尼对HCC的疗效[28]。HCC异种移植物中，奥沙利铂与CQ的组合相较任一单药使用均显示出更明显的抑制肿瘤作用。类似地，在HCC细胞系中予CQ和索拉非尼共同给药，可观察到两者联用发挥出显著的肿瘤抑制作用。此外，HCC细胞系中，Atgs的沉默可抑制特异性自噬功能，并促进化疗药物诱导细胞死亡。近期研究表明，热休克转录因子1（HSF1）可增强Atg4B基因启动子（-1429至-1417）的转录活性，研究者进一步通过裸鼠实验证实HSF1或Atg4B的敲除可增强表柔比星(EPI)在体内的抗HCC作用。这些结果表明，HSF1可促进Atg4B表达，通过增强保护性自噬来降低HCC细胞对EPI的敏感性，这项结果提示“HSF1/Atg4B/保护性自噬”途径可能是开发肝癌敏感化疗药物的新靶点[29]。也有研究发现，汉黄岑素联用索拉非尼时可有效抑制其诱导的自噬，从而更有效地杀死人类HCC细胞[30]。而奥沙利铂，5-氟尿嘧啶和吡柔比星（THP）等抗肿瘤试剂治疗也被证实可显著诱导LncRNA HULC表达和保护性自噬发生。HULC的沉默可抑制保护性自噬，自噬受到抑制后HCC细胞对3种药物的敏感性均增强。HULC的异位表达诱导HCC细胞自噬与稳定无声信息调节蛋白1（Sirt1）密切相关。另外，HULC可上调泛素特异性肽酶22（USP22）的表达，减少泛素介导的Sirt1蛋白降解。因此有学者认为，“HULC/USP22/Sirt1/保护性自噬”通路的激活会减弱HCC细胞对化疗药物的敏感性[31]。多柔比星（Dox）也被认为诱导自噬发生，抑制Dox诱导的自噬可促进HCC细胞凋亡。在30例HCC患者中研究发现，miR-26a/b在肿瘤细胞中表达显著下调，与自噬启动蛋白ULK1的表达水平负相关。miR-26a/b通过靶向ULK1在初始阶段抑制自噬通量，而后进行的体外实验证实了miR-26a/b过表达可增强HCC细胞对Dox的敏感性，并发现其通过抑制自噬来促进细胞凋亡[32]。

4 自噬激活剂治疗HCC

许多研究聚焦于自噬发生对肿瘤细胞的保护性作用，由此进行药物相关实验。PI3K/Akt/mTOR途径是癌细胞中细胞增殖、生长、存活、蛋白质合成和葡萄糖代谢的主要调节通路。mTOR抑制剂在HCC中显示出抗肿瘤活性，这表明靶向该途径可能有益于HCC的治疗。雷帕霉素及其衍生物作为mTOR抑制剂，是常见的自噬诱导剂。一项Ⅱ期临床试验发现，雷帕霉素在25例晚期HCC患者中显示出抗肿瘤作用[33]。肝移植后予基于雷帕霉素的免疫抑制方案可改善HCC患者OS[34]。然而，由于每种药物的临床数据不足，推广雷帕霉素及其衍生物尚为时过早。曾有学者认为依维莫司（RAD001）在人类HCC的异种移植模型中显示抗肿瘤活性[34]；然而，有研究显示，它在Ⅲ期试验中对生存和疾病进展没有益处[35]。相比之下，更多的靶向mTOR与RAD001和PI3K/mTOR双重抑制剂在HCC的小鼠模型中可增加肿瘤自噬/线粒体自噬，减少肿瘤大小，显示出更大的功效[36]。最近发现一种CDK4/6抑制剂帕博昔布（Palbociclib）对于治疗HCC具有重大临床意义。帕博昔布被证实可通过激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）和抑制蛋白磷酸酶5（PP5）从而诱导HCC细胞的自噬和凋亡。因此帕博昔布可能成为另一针对肝癌细胞自噬及凋亡的靶向药物[37]。另有研究发现，聚胺亚精胺可诱导肿瘤细胞发生自噬，启动氧化应激诱导的细胞死亡，从而阻止肝纤维化和肝细胞癌的发生。研究人员发现MAP1S可正向调节细胞内的自噬流量，MAP1S缺陷小鼠中位生存期降低20%，并且在应激下进展为严重的肝纤维化和HCC。用亚精胺处理的野生型小鼠或细胞通过消耗溶质HDAC4增加MAP1S稳定性和自噬信号。口服亚精胺可延长小鼠的寿命，终生给药可以将生命延长25%，也减少了由化学物质引起的肝纤维化和肝癌病灶。更重要的是，亚精胺的影响依赖于MAP1S介导的自噬。此研究为口服亚精胺的治疗提供了临床前证据[38]。

5 小结与展望

自噬不仅是简单的细胞代谢过程，更参与肝脏纤维化、慢性炎症甚至肝癌的发生、发展。自噬在肝癌中起着双重作用，也许与HCC肿瘤的异质性、肿瘤细胞状态、肿瘤存在环境均相关。因此，HCC发生自噬的复杂性或需要个性化的管理方法。虽然研究表明自噬调节剂可作为HCC的高潜力治疗方法，但这些自噬调节剂的效果与安全性仍需临床数据验证。关于自噬的多样化和复杂过程尚未确定，临床仍需确定自噬的具体分子机制，以寻找新的治疗靶点，并克服对当前治疗的耐药性。另外，相关生物调节剂及自噬相关生物标记因子仍待发掘。

[1]Rautou PE,Mansouri A,Lebrec D,et al.Autophagy in liver diseases[J].Journal of Hepatology,2010,53(6):1123-1134.

[2]Singh R,Cuervo AM.Autophagy in the cellular energetic balance[J].Cell Metab,2011,13(5):495-504.

[3]Zhong Z,Sanchez-Lopez E,Karin M.Autophagy,Inflammation,and Immunity:A Troika Governing Cancer and Its Treatment[J].Cell,2016,166(2):288-298.

[4]Wilhelmus,Kwanten,Martinet,et al.Role of autophagy in the pathophysiology of nonalcoholic fatty liver disease:A controversial issue[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(23):7325-7338.

[5]Cianfanelli V,Fuoco C,Lorente M,et al.Corrigendum:AMBRA1 links autophagy to cell proliferation and tumorigenesis by promoting c-Myc dephosphorylation and degradation[J].Nature Cell Biology,2015,17(1):20-30.

[6]Sun K,Xu L,Jing Y,et al.Autophagy-deficient Kupffer cells promote tumorigenesis by enhancing mtROS-NF-κB-IL1α/β-dependent inflammation and fibrosisduring the preneoplastic stage of hepatocarcinogenesis[J].Cancer Lett,2017,388:198-207.

[7]Bao L,Chandra PK,Moroz K,et al.Impaired autophagy response in human hepatocellular carcinoma[J].Experimental&Molecular Pathology,2014,96(2):149-154.

[8]Jain A,Lamark T,Sjttem E,et al.p62/SQSTM1 Is a Target Gene for Transcription Factor NRF2 and Creates a Positive Feedback Loop by Inducing Antioxidant Response Element-driven Gene Transcription[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(29):22576-22591.

[9]Ni HM,Woolbright BL,Williams J,et al.Nrf2 promotes the development of fibrosis and tumorigenesis in mice with defective hepatic autophagy[J].Journal of Hepatology,2014,61(3):617-625.

[10]Russell RC,Yuan HX,Guan KL.Autophagy regulation by nutrient signaling[J].Cell Research,2014,24(1):42-57.

[11]Saito T,Ichimura Y,Taguchi K,et al.p62/Sqstm1 promotes malignancy of HCV-positive hepatocellular carcinoma through Nrf2-dependent metabolic reprogramming[J].Nature Communications,2016,7:12030.

[12]Kenerson HL,Subramanian S,Mcintyre R,et al.Livers with constitutive mTORC1 activityresist steatosis independent of feedback suppression of Akt[J].Plos One,2015,10(2):e0117000.

[13]Totoki Y,Tatsuno K,Covington KR,et al.Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes[J].Nature Genetics,2014,46(12):1267-1273.

[14]Umemura A,He F,Taniguchi K,et al.p62,Upregulated during Preneoplasia,Induces Hepatocellular Carcinogenesis by Maintaining Survival of Stressed HCC-Initiating Cells[J].Cancer Cell,2016,29(6):935-948.

[15]Mathew R,Karantzawadsworth V,White E.Role of autophagy in cancer[J].Medical Recapitulate,2010,7(12):961.

[16]Abdelwahab R,Shehata S,Hassan MM,et al.Validation of an IGF-CTP scoring system for assessing hepatic reserve in egyptian patients with hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2015,6(25):21193-21207.

[17]Wu DH,Jia CC,Chen J,et al.Autophagic LC3B overexpression correlates with malignant progression and predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol,2014,35(12):12225-12233.

[18]Rao S,Tortola L,Perlot T,et al.A dual role for autophagy in a murine model of lung cancer[J].Nature Communications,2014,10(3):529-531.

[19]Rosenfeldt MT,O'Prey J,Morton JP,et al.p53 status determines the role of autophagy in pancreatic tumour development[J].Nature,2013,504(7479):296.

[20]Tian Y,Kuo C,Sir D,et al.Autophagy inhibits oxidative stress and tumor suppressors to exert its dual effect on hepatocarcinogenesis[J].Cell Death&Differentiation,2014,22(6):1025-1034.

[21]Liu H,Ma Y,He HW,et al.SPHK1(sphingosine kinase 1)induces epithelial-mesenchymal transition by promoting the autophagy-linked lysosomal degradation of CDH1/E-cadherin in hepatoma cells[J].Autophagy,2017,13(5):900-913.

[22]Yang X,Yu DD,Yan F,et al.The role of autophagy induced by tumor microenvironment in different cells and stages of cancer[J].Cell&Bioscience,2015,5(1):14.

[23]Areerat K,Ingorn K,Tanapat P,et al.Increased ATG5-ATG12 in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma and their role in apoptosis[J].World Journal of Gastroenterology,2016,22(37):8361-8374.

[24]Zhang Q,Yang M,Qu Z,et al.Autophagy prevention sensitizes AKTi-1/2-induced anti-hepatocellular carcinoma cell activity in vitro and in vivo[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2016,480(3):334-340.

[25]Yan Y,Jiang K,Liu P,et al.Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways[J].Scientific Reports,2016,6:37052.

[26]Egan DF,Chun MG,Vamos M,et al.Small Molecule Inhibition of the Autophagy Kinase ULK1 and Identification of ULK1 Substrates[J].Molecular Cell,2015,59(2):285-297.

[27]Jiang P,Mizushima N.Autophagy and human diseases[J].Cell Research,2014,24(1):69-79.

[28]Zhi X,Zhong Q.Autophagy in cancer[J].F1000prime Reports,2015,7:18.

[29]Zhang N,Wu Y,Lyu X,et al.HSF1 upregulates ATG4B expression and enhances epirubicin-induced protective autophagy in hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Letters,2017,409.

[30]Rong LW,Wang RX,Zheng XL,et al.Combination of wogonin and sorafenib effectively kills human hepatocellular carcinoma cells through apoptosis potentiation and autophagy inhibition[J].Oncology Letters,2017,13(6):5028-5034.

[31]Xiong H,Ni Z,He J,et al.LncRNA HULC triggers autophagy via stabilizing Sirt1 and attenuates the chemosensitivity of HCC cells[J].Oncogene,2017,36(25):3528-3540.

[32]Jin F,Wang Y,Li M,et al.MiR-26 enhances chemosensitivity and promotes apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through inhibiting autophagy[J].Cell Death&Disease,2017,8(1):e2540.

[33]Zou M,Lu N,Hu C,et al.Beclin 1-mediated autophagy in hepatocellular carcinoma cells:implication in anticancer efficiency of oroxylin A via inhibition of mTOR signaling[J].Cellular Signalling,2012,24(8):1722-1732.

[34]Decaens T,Luciani A,Itti E,et al.Phase II study of sirolimus in treatment-naive patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].Digestive&Liver Disease,2012,44(7):610-616.

[35]Toso C,Merani S,Bigam DL,et al.Sirolimus-based immunosuppression is associated with increased survival after liver transplantation for hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,51(4):1237-1243.

[36]Zhu AX,Kudo M,Assenat E,et al.Effect of everolimus on survival in advanced hepatocellular carcinoma after failure of sorafenib:the EVOLVE-1 randomized clinical trial[J].Jama,2014,312(1):57-67.

[37]Hsieh F,Chen Y,Hung M,et al.Palbociclib induces activation of AMPK and inhibits hepatocellular carcinoma in a CDK4/6‐independent manner[J].Molecular Oncology,2017,11(8):1035.

[38]Yue F,Li W,Zou J,et al.Spermidine prolongs lifespan and prevents liver fibrosis and hepatocellular carcinoma by activating MAP1S-mediated autophagy[J].Cancer Research,2017,77(11):2938-2951.