胰腺癌循环肿瘤细胞的临床应用研究进展

陈敏捷 钟征翔

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在全球范围内成快速上升趋势。2014年WHO公布的全球恶性肿瘤统计资料显示，胰腺癌的发病率在恶性肿瘤中居第13位，但其病死率却高居第4位[1]。国内的调查显示，胰腺癌发病率位列我国恶性肿瘤的第10位，病死率居第6位[2]。确诊胰腺癌的患者1年生存率＜10%，5年生存率＜5%，是预后最差的恶性肿瘤之一[3]。随着手术、化疗、放疗技术进步，胰腺癌诊治水平有了很大提高，但整体预后仍未得到明显改善[4]。胰腺癌患者的预后不良与术后短时间内复发转移密切相关[5]，胰腺癌经常经血运转移至肝脏、肺、骨骼等远处器官。因此，早期发现外周血中是否存在微转移，加强对胰腺癌复发与远处转移的监测和治疗是改善患者预后的重要手段[6]，但临床上缺乏高灵感度与特异度的血液指标来判断早期胰腺癌复发与转移，腹部彩超、CT等影像学检查效果也欠佳。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指自发或因操作由原发病灶或转移病灶释放进入外周循环的肿瘤细胞，它可定植在远处组织并形成新的转移灶。这些转移灶的肿瘤细胞表型和表达谱与原发灶相似，因此CTCs作为原发肿瘤的“液体活检标本”可为实时、无创的监测肿瘤发展提供条件。近年来，随着CTCs富集及鉴定技术不断发展，CTCs在恶性肿瘤复发与转移过程中的研究越来越受到重视。研究显示，CTCs检测在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中具有早期诊断、检测复发与转移、制定个体治疗方案及判断预后等临床价值[7-9]。本文系统地回顾近年来的研究报道，就CTCs富集、鉴定方法及CTCs检测在胰腺癌诊治中的应用研究进展综述如下。

1 CTCs的富集

CTCs在外周循环中及其罕见[10]，研究时通过灵敏的方法浓缩富集CTCs是不可缺少的步骤。目前主要的富集方法有：基于物理学特征（大小、密度、电荷等）的密度梯度离心法、膜滤过富集法等；基于生物学特征（细胞表面蛋白等）的免疫富集法。

1.1 物理学富集法 密度梯度离心法是基于血液中各种细胞密度各不同的特点从而分离肿瘤细胞的一种技术。其分离的关键是高质量的分离介质。目前主要的分离介质有PtiPrep分离液、Percol分离液、Ficoll分离液及OncoQuick分离液等，其中后两者较为常用。一项对比研究显示，Ficoll与OncoQuick富集效率相似，均为70%～90%，但后者的灵敏度较前者有189倍的大幅度提高，单核细胞去除得以简化，其特有的渗透性屏障可防止富集后的细胞移入其他组分[11]。美中不足的是，OncoQuick需要的血液样本量较大，约15～30ml，总体的灵敏度与特异度仍较低，限制了其进一步应用。

膜滤过富集法是利用肿瘤细胞体积大于外周血细胞的原理建立的分离方法，如ISET分离法、ScreenCell分离法等。Vona等[12]提出的ISET分离技术通过设计滤过膜的孔径富集CTCs，大多数研究报道滤过膜孔径在8μm大小时，滤过效果较好。但并非所有的肿瘤细胞直径均＞8μm，且血细胞的直径也并非均＜8μm，因此该方法特异性较差，易导致肿瘤细胞丢失与假阳性的发生。

总体来说上述基于物理学的CTCs富集方法优势在于操作简单、方便，成本较低，获取的肿瘤细胞保留活力，方便后续的细胞形态观察和分子生物学检测；但这些方法特异度和敏感度均较差，极易出现肿瘤细胞的丢失，出现假阴性或其他血细胞及正常人体脱落细胞的干扰出现假阳性，获得的肿瘤细胞纯度低，使得应用受到限制。

1.2 免疫学富集法 免疫学富集法是基于上皮源性的恶性肿瘤均表达上皮黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和细胞角蛋白（cytokeratins，CK）等标记物的特点，依赖抗原-抗体特异性结合获取肿瘤细胞的方法。其中代表性的方法有：免疫磁珠分选法、CTC-Chip法。

免疫磁珠分选法利用CTCs表面标记物EpCAM可与连接有免疫磁性微球的特异性单抗相结合，形成“抗原-抗体-磁珠”复合物，在外加磁场作用下吸附复合物，富集靶细胞；其包括阴性富集法及阳性富集法。目前应用范围较广的CTCs富集方法，如免疫磁性细胞分选仪(MACS)、CellSearch系统和AdnaTest癌细胞检测系统等均基于此法。其中CellSearch是唯一通过美国FDA批准用于临床乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的CTCs检测与分析的系统[13]，运用该系统在胰腺癌CTCs研究中也取得了一定进展[14-15]。

CTC-Chip法技术是居于微流体芯片的基础上，在微流通道表面包覆了78 000个EpCAM抗体位点，在血液样本进入芯片后，通道表面抗体通过抗原-抗体反应捕获CTCs。Nagrath等[16]用CTC-Chip检测15例胰腺癌患者均发现CTCs，数量在9～831个不等。第二代CTCChip芯片又称为几何增强混合芯片（GEM-Chip），其在一代芯片的基础上设计了一种小室流动槽，可使样品流体快速混合，显著提高捕获细胞的数量，研究人员还在血液样本中捕捉到4～12个CTCs群，这是其他CTCs分离方法从未报道过的[17]。为进一步检测研究肿瘤细胞群，研究团队据此研发出一种用于捕捉2个或2个以上CTCs组成细胞群的最新微流体装置，名为Cluster-Chip，他们使用Cluster-Chip发现30%～40%的转移性乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤患者存在肿瘤细胞群，并通过RNA序列证实了它们的肿瘤起源[18]。这使其可能成为检测肿瘤细胞群特性、发现肿瘤干细胞、研究肿瘤复发转移的新方法。

免疫学富集法使CTCs保留了细胞的完整性，灵敏度与特异度较高，所需血液样本量也较少，易于重复测定。但CTCs存在异质性，且肿瘤细胞在转化、演变及上皮间质化（EMT）过程中可能会丢失其表面抗原，因此该方法可能会导致CTCs的遗漏，产生假阴性。

2 CTCs的鉴定

目前的分离技术无法百分百的富集CTCs，仍有部分血细胞会混杂在样本当中，因此有效的CTCs鉴定技术显得格外重要。CTCs鉴定主要是通过检测肿瘤细胞特异性表面标志物、分泌蛋白及基因等确定肿瘤细胞。常用的CTCs检测技术有：细胞化学染色检测法、核酸检测法、免疫荧光细胞化学法（ICC）、荧光原位杂交技术（FISH）及酶联免疫分析技术（EPISPOT）等。

2.1 细胞化学染色检测法 细胞化学染色检测CTCs是基于细胞内的酸碱性物质能与相应的碱或酸性染料结合，显示出现不同颜色的原理，包括瑞士染色、吉姆萨染色、苏木精-伊红（HE）染色等。有研究对179例胰腺病变的患者利用吉姆萨染色方法检测CTCs，发现除胰腺癌患者外周血存在异形细胞外，在其他胰腺病变患者的外周血中均能找到类似的异形细胞，且这些异形细胞与肿瘤细胞较难鉴别[19]。细胞化学染色检测法操作简单，成本较低，但单从形态学鉴定肿瘤细胞较为困难，易受血液中炎症细胞、正常上皮细胞及病理科医生水平等干扰，且肿瘤细胞从原发肿瘤细胞脱落及在外周血中转化演变过程中可能存在形态学的改变，这使其应用受到限制。

2.2 ICC ICC的基本原理是抗原-抗体结合反应，利用单克隆抗体与特异的肿瘤标志物结合，通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞，能对肿瘤细胞进行定量、定性分析，是CTCs鉴定中应用最广的技术之一。CellSearch系统的CTCs鉴定部分基于此法，它利用经典的 CK8/18/19、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、CD45 标志物组合对富集样本进行检测，将 CK8/18/19（+）、DAPI（+）、CD45（-）的定义为肿瘤细胞[20]。目前ICC已在胰腺癌CTCs中广泛使用，较为常见的肿瘤标志物有：EpCAM、CK、CA19-9、波形蛋白（Vimentin）等[21-25]。ICC 鉴定 CTCs受人为因素干扰较少，多种标志物联合检测有效地提高了该方法的灵敏度与特异度。但由于一些良性上皮增殖性疾病、手术、炎症和组织创伤均可导致上皮细胞进入外周血，这些细胞表面存在同样上皮特异性抗原，易导致假阳性的发生；同时在肿瘤EMT及转化演变过程中，CTCs表面特异性标志物减弱甚至丢失，导致假阴性的发生。随着对CTCs异质性的进一步研究，特异性肿瘤免疫标志物的出现，该方法在CTCs鉴定中必有广阔的前景。

流式细胞技术（FCM）是一项以细胞荧光化学及单克隆抗体技术为基础，集激光、电子物理、光电测量、计算机为一体的新型技术。其可以定量计数肿瘤细胞数量，检测数据较精确，还可对细胞进行多参数分析。但其检测成本较高，且FCM检测靶细胞的灵敏度为1/1～10万，但外周血中CTCs数量常＜1/100万，故CTCs数量一定程度上限制了FCM在此领域的应用[26]。近年来在此基础上发展出了许多改良技术，如光纤阵列扫描技术（FAST）、镭射扫描细胞技术（LSC）、自动细胞显像系统（ACIS）等大大提高了免疫荧光鉴定效率。Hsieh等[27]利用FAST对3份加入10～21个结肠癌HT-29细胞的血液标本进行检测，灵敏度达到98%。

2.3 核酸检测法 通过检测肿瘤细胞的特异性遗传物质来鉴定CTCs存在，如原癌基因、抑癌基因突变、染色体重排、微卫星不稳定及致瘤病毒序列等。聚合酶链式反应（PCR）一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现，PCR技术不但能有效地检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。但因大多数实体肿瘤DNA变化不明显，且游离DNA不能明确就是肿瘤细胞来源，所以PCR检测CTCs有待进一步研究。

逆转录-集合酶链式反应（RT-PCR）是在PCR的基础上扩增有肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段的方法，它可识别肿瘤细胞特异性的mRNA。该技术灵敏度高，可在107～108个外周血单核细胞中检测出单个肿瘤细胞，但是由于核酸起源不明确，RT-PCR检测CTCs时，结果可能会出现假阳性，影响检测的特异性。为提高检测的特异度和灵敏度，研究者使用免疫磁珠与RT-PCR 联合多个 mRNA（hTERT、C-MET、CK-20及CEA）鉴定CTCs，阳性率显著提高[28]。近年来，实时定量探针-PCR（QPCR），荧光定量-PCR（FQPCR）、巢式定量-PCR等新方法的出现，显著提高了扩增效率和检测灵敏度，目前应用较广泛，是检测鉴定CTCs的有效手段。

2.4 FISH FISH是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。Zhang等[29]依靠免疫磁珠富集胰腺癌CTCs后联合CK、CD45、DAPI荧光染色及CEP8荧光探针法鉴定CTCs，其将CK+CD45-DAPI+CEP8=2，CK+CD45-DAPI+CEP8＞2 和 CK-CD45-DAPI+CEP8＞2定义为CTCs，诊断胰腺癌的灵敏度为68.18%，特异度为94.87%。FISH在CTCs诊断上特异性较高，但其检测成本较高，探针设计不合理，环境样品干扰等可能导致假阳性的发生。

2.5 EPISPOT EPISPOT是另一种基于检测肿瘤细胞分泌的特异性标志蛋白的免疫方法。在该技术中，细胞分泌蛋白直接与载破片上特定荧光抗体结合，检测CTCs的存在。通过检测 CK19、Her2、MUC1、ERFR 等位点，已在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中得到应用[30-31]。此法可以验证CTCs的活性，还能检测肿瘤形成的分泌蛋白，对肿瘤复发转移的相关性研究具有重要的意义。但该法检测灵敏度低，无法估计CTCs的数量，应用于CTCs检测的可行性还需进一步研究验证。

3 CTCs检测在胰腺癌诊治中的应用

3.1 CTCs检测在胰腺癌诊断中的应用 目前临床上缺乏有效的血液标准判断早期胰腺癌，腹部彩超、CT等影像学检查效果欠佳。研究显示，在肿瘤形成早期癌细胞就可以从原发灶脱落或经EMT进入外周血[32]，因此作为“液体活检”检测CTCs可能可以提高肿瘤早期的诊断效率，甚至监测癌前病变预测肿瘤的发生、发展。刘艳辉等[33]采用免疫磁珠结合免疫荧光方法对胰腺癌患者进行检测，CTCs的检测率为88.41%，且CTCs的检出情况和血清CA19-9升高水平具有相关性，认为CTCs检测可提高胰腺癌的诊断率。Rhim等[34]在胰腺导管内乳头状黏液肿瘤（IPMN）中也成功检测出CTCs，并指出CTCs是可预测胰腺癌的诊断指标。Kurihara等[35]在胰腺癌与肿瘤分期的研究中显示随着肿瘤分期升高，CTCs检测率和数目逐渐升高，推断CTCs能成为肿瘤分期中一项重要的参考数据。

3.2 CTCs在肿瘤复发、转移中的应用 手术切除是早期胰腺癌的主要治疗手段，复发和转移是手术治疗失败的主要原因，也是影响患者生存期的重要因素，监测肿瘤术后早期复发和转移成临床亟待解决的问题。在一项乳腺癌的研究中表明，CTCs检测有助于早期微转移及术后复发转移的诊断，尤其是对那些肿瘤较小，在影像学不能清晰显示的微转移瘤有重要临床价值。Tanaka等[36]检测肺癌CTCs，分析发现CTCs水平与肿瘤远处转移具有相关性，发生转移者CTCs数目增多，其检测率的敏感性及特异性分别为71%和83%。张建伟等[37]利用免疫磁珠结合免疫荧光检测83例胰腺癌手术患者CTCs，结果显示CTCs数量与淋巴结转移具有相关性（P=0.027，logistic回归分析）。CTCs与胰腺癌早期微转移及术后复发转移的相关性及机制还有待进一步研究。

3.3 CTCs检测在指导胰腺癌化疗中的应用 化疗是胰腺癌除手术之外的主要治疗手段之一，但化疗患者生存率仍＜5%[38]。在化疗前后监测CTCs变化可进一步揭示肿瘤对化疗药物的抗药性并预测化疗效果[39]。Torphy等[40]建立胰腺导管腺癌小鼠模型，随机分为化疗组与空白组，计数治疗前后CTCs变化，化疗组接受治疗后CTCs数量明显减少（26.61 vs 2.21，P=0.0207）。Ren等[25]对41例胰腺癌患者在接受5-氟尿嘧啶治疗前后利用免疫荧光法进行了CTCs检测发现，治疗前有33例患者CTCs＞2个，在接受治疗1周后这项数据减少到13例，这表明CTCs检测可作为检测药效的指标。

目前根据胰腺癌患者组织学活检特点，针对肿瘤细胞与肿瘤信号传导通路的个体化治疗备受关注。针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向治疗药物埃罗替尼（Erlotinib）已被美国FDA批准与吉西他滨联合应用于胰腺癌一线治疗的靶向治疗药物[41]。Toubaji等[42]对5例KRAS基因突变的胰腺癌患者相应的予以KRAS蛋白疫苗，结果显示无进展生存期（PFS）为35.2个月，总生存期（OS）为44.4个月。除此之外针对胰腺癌锌指蛋白217（ZNF217）、Hedgehog信号传导通入等的研究也取得一定进展[43-44]。但由于药物的使用、肿瘤的演变，可能使肿瘤基因型发生改变，无法定期获取组织标本，使个体化用药在一定程度上受到限制，而CTCs作为两者之间的桥梁，能同时反映原发灶和转移灶的性质[45]，其在个体化治疗中有广泛的应用前景。

3.4 CTCs在评估胰腺癌预后中的应用 胰腺癌进展快、预后差，但目前尚无有效评估其预后的指标。De Albuquerque等[46]利用免疫磁珠富集法联合RT-PCR检测34例胰腺癌患者外周血CTCs,并分析CTCs与PFS的相关性，CTCs阳性的16例患者PFS中位数为66d，CTCs阴性的患者PFS中位数为138d，其差异有统计学意义（P=0.01）。Han等[47]对多个数据库623例胰腺癌患者进行Meta分析，发现268例CTCs阳性，355例CTCs阴性，CTCs阳性组的PFS及OS较短。Chang等[48]通过微流控芯片联合免疫荧光检测63例胰腺癌患者循环微癌栓（CTM），其中51例检测出CTM，在CTM与OS及PFS的相关性研究中显示，CTM阳性患者对比CTM阴性的患者 OS（6.4 月 vs 19.8 月，P＜0.0001）及 PFS（2.7月vs 12.1月，P＜0.0001）较短。上述研究结果基本一致，外周血CTCs数量与胰腺癌PFS及OS显著相关，提示CTCs可作为判断胰腺癌患者预后的检测标志物。但研究人员也指出小样本单变量的CTCs检测预测胰腺癌预后并无多大的统计学意义[49]，因此CTCs临床应用价值仍需多中心、大样本的研究加以确认。

4 小结

综上所述，CTCs检测在胰腺癌诊治中具有广阔的前景，探索分析CTCs对临床研究胰腺癌意义重大。但目前的CTCs检测尚处于科研阶段，临床应用还存在诸多问题，如（1）胰腺癌CTCs的富集方法较多，无统一标准，不同方法的富集效率参差不齐；（2）与乳腺癌、肺癌相比，胰腺癌缺乏特异性的肿瘤标志物，限制了CTCs的临床检测；（3）CTCs数量在胰腺癌的诊断、判断转移、分析预后中无定论，仍需要大规模多中心的研究；（4）对于早期CTCs阳性的患者如何进行下一步诊治仍需进一步探索；（5）胰腺癌肿瘤干细胞的研究尚处于瓶颈阶段；（6）痕量的CTCs体外培养可行性还需进一步研究；（7）基于胰腺癌CTCs的分子靶向治疗还有待进一步开发研究。因此，在进一步改善方法学研究胰腺癌CTCs数量与临床关系的同时，关注CTCs本身的基因表型，探索CTCs异质性将会是未来研究的重点。

相信随着现代生物科学技术的不断发展，对胰腺癌CTCs的研究不断深入，作为可替代侵入性组织活检的“液体活检”，CTCs检测将为胰腺癌的早期诊断、监测复发转移、制定个体治疗方案及判断预后等提供新思路。

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