结核病的代谢组学研究进展

韦金涛 李华 邱恩明

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的一种慢性致死性传染病，是目前全球单一病原体感染引起死亡的最主要原因，高于艾滋病[1]。作为一种胞内寄生菌，MTB依靠宿主细胞获取其生命所需多种营养物质，并通过影响宿主细胞代谢从而引起宿主组织器官及各个系统水平的能量以及代谢紊乱[2]。因此，结核病患者体内往往存在蛋白质代谢、糖代谢等多种代谢紊乱。这为代谢组学研究广泛应用于结核病研究奠定了基础。

结核病疫情现状

据估计截至2014年，全球MTB潜伏感染者已多达17亿，占全球总人口的1/4[3]。受到HIV感染、营养不良、烟草等因素的影响，10%的MTB潜伏感染将在生命某一阶段转为活动性结核病[4]。WHO的报告显示，2017年全球因结核病死亡例数多达130万例(不包括30万例HIV并发结核感染的死亡患者)，另外全球预计新发1000万例结核病，新增55.8万例利福平耐药患者(其中82%为耐多药结核病)[1]。耐药结核病及HIV并发结核感染已成为终止结核病流行的重大障碍。

近年来，由于卡介苗接种、现有结核病诊断检测手段的敏感度和特异度不足、新型检测方法的成本高且临床操作复杂等因素的影响，现有结核病诊断检测手段已不能完全满足当前结核病防治的需求。寻找高效、迅速、简便且敏感度与特异度高的新型结核病诊断检测方法是当务之急。同时，现有抗结核药物存在多种不良反应，迫切需要研制新型抗结核药物，其药物不良反应产生的具体机制也有待进一步阐明；另外对患者经抗结核药物治疗后的效果评估也日趋重要。除此之外，寻找MTB毒力的影响因素、耐药结核病的成因等依旧是当前面临的重大难题。

代谢组学研究的优势及现状

代谢组学是一种对相对分子质量<1000的小分子代谢物进行表征的新兴组学技术，主要用于研究基因、蛋白质和外界环境作用下机体代谢物的数量、种类及其变化规律。作为其他组学的最下游产物，代谢组学之前的基因、转录、蛋白质组学任一层面的改变都将影响特定代谢物的数量甚至存在状态[5]。与受到表观遗传调节和翻译后修饰的基因和蛋白质不同，代谢物可作为机体生化过程的直接标记，更加容易和表型相关联[6]。因此，代谢组学与其他组学相比能更直接且全面地反映机体状态。

目前，代谢组学研究模式主要分为靶向和非靶向两种。常用技术主要包括核磁共振(MR)、质谱(MS)、气相色谱(GC)、液相色谱(LC)等。MR因为能提供大量物质结构信息而主要用于组织结构鉴定[7]，但其敏感度稍弱且对低丰度代谢物的检测能力较差，对仪器要求也更高更昂贵[8]。MS则对样本需求小、成本低，能对脂质、核苷类生物小分子，以及蛋白质、多肽等大分子进行测定及结构鉴定[7, 9]。近年来为了提高MS的敏感度、分辨率和选择性，常将MS与多种技术联用[8]。主要包括气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS) 及液相色谱-串联质谱技术等。MS与其他技术联用已成为代谢组学研究的常态。在数据统计分析方面，主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)是当前代谢组学研究最常用的分析方法，在寻找疾病诊断标记物中扮演着重要角色。目前，代谢组学已广泛应用于卵巢癌、肺癌、糖尿病、肝癌、结核病等诸多临床疾病的研究，在疾病诊断和治疗方面的进展十分迅速，已成为一种不可或缺的临床研究工具。

代谢组学在结核病研究中的进展

一、 MTB毒力的相关研究

MTB的毒力强弱与其致病性密切相关，其毒力相关因子很可能是未来抗结核药物作用的潜在靶标。研究表明，MTB毒力主要与早期分泌蛋白、肽聚糖、分枝菌酸、代谢及转录因子等有关[10]。代谢作为MTB毒力的先决条件，在维持MTB毒力过程中不可或缺[11]。Puckett等[12]利用液相色谱-质谱(LC-MS)对惟一编码苹果酸合酶的glcB基因敲除菌株进行代谢监测，发现苹果酸合酶的缺失会引起乙醛酸的积累及苹果酸、天冬氨酸的减少，最终造成苹果酸合酶缺陷菌株毒力衰减并出现生长抑制甚至死亡，虽然具体生理机制有待阐明，但苹果酸合酶维持正常乙醛酸水平的功能已被证明对MTB毒力的维持至关重要。Ganapathy 等[13]基于代谢组学平台发现果糖二磷酸酶(FBPase)的缺失能够造成糖异生途径的中断，导致MTB毒力丧失从而被机体清除，但糖异生途径中断造成的磷酸化产物积累可能不是导致MTB被清除的原因。目前的研究表明，某些代谢途径的中断会导致MTB毒力减弱甚至死亡，但具体生理机制及其与代谢物积累之间的关系还需做进一步研究。

二、MTB与宿主营养机制的研究

从宿主细胞获取营养是MTB存活的基础。Zimmermann等[14]基于四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF)对MTB感染的细胞进行非靶向代谢组学分析，发现宿主细胞能为MTB提供氨基酸、核苷酸、脂质、脂肪酸等多种营养物质；将其代谢组学和转录组学数据整合到无偏基因组规模代谢网络模型，发现MTB在感染宿主巨噬细胞的早期需要消耗胆固醇、硬脂酸盐、胞苷等33种不同的营养物质，这种宿主的多重营养供应将使MTB对外界干扰(如机体先天性免疫、抗生素等)具有一定的抵抗性，可望成为结核干预治疗的代谢靶标。

宿主可通过“营养免疫”策略对在宿主细胞内消耗的营养物质进行调控来限制MTB生长[11]。Fe是MTB体内多种酶的氧化还原辅助因子，也是MTB在巨噬细胞中生长的必需元素[15]。Kurthkoti等[16]发现，结核肉芽肿中存在“Fe限制”环境，该环境中MTB对Fe的获取受限从而阻碍MTB生长；超高液相色谱-质谱(UPLC-MS)联合转录组学测序技术(RNAseq)研究发现，MTB通过对蛋白质中Fe的重吸收利用来抵抗这一不利环境。由此可见，宿主细胞既为MTB提供营养，又通过一系列策略消灭MTB，探索二者之间的关系对未来抗结核治疗具有重要意义。

三、 MTB耐药性的相关研究

MTB耐药性是“消灭结核病”的一大障碍。编码药物作用靶分子的基因产生突变是目前MTB耐药性形成的主要原因，但临床上依然有5%～35%的MTB耐药性形成不能用已知的基因突变解释[17]。代谢组学已成为寻找未知MTB耐药机制的有力工具。Nandakumar等[18]基于液相色谱-飞行时间质谱(LC-TOF-MS)技术对抗结核药物作用的MTB内源代谢库进行表征，发现MTB内部的异柠檬酸裂解酶(ICL)能够抵抗抗生素诱导的氧化应激，从而介导广泛的抗生素耐受性。对于生理浓度下NaCl介导的MTB表型耐药性，Larrouy-Maumus等[19]运用LC-MS联合13C标记技术发现，一定浓度的NaCl可导致MTB三羧酸循环和糖异生途径的广泛改变，但这并非生理浓度下NaCl介导MTB表型耐药性产生的原因。HPLC-MS的脂质组学研究证实，质膜和外膜脂质重塑才是生理浓度下NaCl介导MTB表型耐药性产生的原因。

表征MTB耐药菌株的代谢特征能够为未来耐药结核病的治疗寻找新的思路。rpoB、katG等基因的突变是导致MTB对INH、RFP等药物产生耐药性的主要原因[17]。Loots等[20-21]运用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF MS)检测方法分别对rpoB和katG基因突变诱导的对RFP和INH耐药的菌株进行代谢监测，发现对RFP耐药的菌株中当乌头酸全部耗竭会导致MTB 的mRNA不稳定，进而干扰MTB能量产生和代谢障碍，最终影响MTB生长；发现对INH耐药的菌株中对羟基苯甲酸、尸胺等抗氧化应激物质增加，表明katG基因的缺失会导致INH耐药菌株中氧化应激增强，MTB可利用抗坏血酸合成途径等多种途径来抵抗增强的氧化应激。耐药基因突变会造成MTB内部较为特异的代谢改变，这些代谢改变很可能成为未来治疗耐药结核病的干扰靶标。

四、代谢组学在结核病诊断中的应用

早诊断是早治疗的前提，也是控制结核病传播的关键。目前，临床结核病实验室的诊断方法主要有痰涂片镜检、PPD皮肤试验和结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)。痰涂片镜检最为特异且操作简便，但阳性率极低。PPD试验易受机体免疫和卡介苗接种的影响而出现假阳性结果[22-23]。临床敏感度和特异度较高的结核病诊断手段是T-SPOT.TB。有研究显示，其敏感度和特异度可分别达到79.7%和85.5%，但由于操作复杂、成本昂贵使其在基层的推广和应用受限[24-25]。因此，亟待开发敏感、特异、且简便快速的新型诊断方法。代谢组学是一种能对生物样品中的代谢物进行无偏差多重分析和比较的新兴技术，具有扩展诊断生物标记物库的潜力[26]。利用代谢组学对机体代谢进行监测并筛选异于常态的代谢诊断标记物是未来结核病诊断的新方向。

尿液样本因代谢信息丰富、无创获取、且便于保存而被广泛应用。Isa等[26]基于高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术确定了活动性肺结核患者尿液样本中10种ROC曲线下面积值>85%的代谢物，最终发现N-乙酰基己糖胺、唾液酸3、新喋呤和二乙酰基精胺等4种物质联合来区别活动性肺结核和非结核性肺病的敏感度和特异度都超过了82.0%。Luier和Loots[27]利用GCxGC-TOF MS鉴定了苯乙酸、色氨酸等17种泌尿系统结核的代谢标记物，表明结核病可引起患者机体脂肪酸和氨基酸特别是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的代谢异常，使患者具有与苯丙酮尿症患者相似的代谢物谱。酪氨酸-苯丙氨酸途径很可能是未来结核病诊断的潜在靶标。

血液是机体代谢物转运的主要媒介。Feng等[28]利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)对结核病患者血清进行分析，鉴定了包括溶血磷脂酰胆碱、棕榈酸等12种特征代谢标记物，研究表明溶血磷脂酰胆碱、山嵛酸、苏氨酰-γ-谷氨酸、前角鲨烯二磷酸等四者的组合是区分活动性结核病最适合的生物标志物组。对难以诊断的小儿结核病，Sun等[29]发现t-缬氨酸，丙酮酸和甜菜碱等3种标志物组合可用于儿童结核病诊断，其敏感度与特异度分别为82.4%和83.9%。

呼出气体是呼吸系统结核病最直接的样本来源。Kuntzel等[30]基于气相色谱-质谱技术对接种分枝杆菌的培养基和对照组培养基上方的挥发性有机物(VOC)进行对比分析，鉴定了包括戊烷、庚烷等在内的17种VOC作为显示分枝杆菌生长的潜在生物标志物。这表明通过对患者呼出气体的标本进行代谢物分析有望成为未来诊断呼吸系统结核病的新手段。

结核病是引起胸腔积液的主要原因之一。Wang等[31]基于1H-NMR技术对20例结核性胸腔积液、20例恶性胸腔积液及18例渗出性胸腔积液标本进行分析，鉴定了包括L-乳酸、果糖、L-丝氨酸在内的26种特征代谢标记，其中乙酸、蛋氨酸、肌酸、柠檬酸、L-丙氨酸、LDL、L-乳酸、L-苏氨酸等8种代谢物有助于区分上述3种胸腔积液。Che等[32]通过整合半靶向代谢组学平台，并运用LC-MS/MS技术对156例患者胸腔积液标本(115例结核性胸腔积液、41例恶性胸腔积液)进行分析，发现结核性胸腔积液患者体内来自色氨酸代谢的犬尿氨酸途径显著增强，该研究表明色氨酸/犬尿氨酸比率在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液方面的特异度和敏感度可分别达到86.1%、92.7%，当与腺苷脱氨酶(ADA)联合诊断结核性胸腔积液时其敏感度和特异度可达到91.3%、97.6%。

结核性脑膜炎(TBM)诊断或治疗的延迟都可能导致严重的神经系统后遗症甚至死亡。Li等[33]基于1H MR技术对比了TBM和病毒性脑膜炎(VM)患者脑脊液的代谢特征，最终鉴定了甘氨酸、葡萄糖、L-谷氨酰胺等25种可用于TBM鉴别诊断的潜在生物标志物。Mason等[34]基于高敏感度气相色谱-质谱(GC-MS)对比了儿童TBM患者和对照组脑脊液的氨基酸谱，发现TBM患者脑脊液内丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸和脯氨酸等5种氨基酸水平显著上升，该研究表明TBM患者中脑脊液中存在大量未开发的生化信息，通过GC-MS进行氨基酸谱分析对TBM的早诊断、早治疗有重要意义。

五、代谢组学在结核病治疗中的应用

(一)抗结核药物不良反应的代谢组学研究

抗结核药物不良反应是抗结核治疗失败的重要原因，明确其不良反应的产生机制对未来指导结核病治疗具有积极意义。代谢组学能够监测药物在机体的代谢状况及药物代谢引起的宿主代谢波动，在药物不良反应研究方面具有很大的价值。Rawat等[35]首次将MR技术应用于吡嗪酰胺(PZA)对肝脏不良反应产生机制的研究，发现PZA的代谢产物吡嗪酸(PA)及5-羟基吡嗪酸(5-OHPA)通过介导氧化应激及炎症反应来诱导大鼠肝不良反应的产生，且5-OHPA诱导肝产生不良反应的能力更强。有研究基于UPLC-MS方法发现抗结核药物所致肝不良反应与磷酸戊糖途径、嘌呤代谢和嘧啶代谢通路有关，其中嘌呤代谢中的黄嘌呤氧化酶能够促进超氧化物的形成从而加重PZA及内源代谢物对产生肝不良反应的效应[36-37]。Ruan等[38]基于MR技术对INH产生急性不良反应的大鼠血清和脑脊液进行分析，发现INH能够以剂量依赖方式诱导氧化应激、兴奋/抑制性神经递质紊乱、能量代谢紊乱及渗透压平衡。Li等[39]利用超高效液相色谱(UPLC)-四极杆飞行时间质谱(QTOF MS)发现高剂量的INH能够以剂量依赖性方式引起小鼠肝脏线粒体功能障碍，以及血红蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等物质积累，并能消耗肝脏中Vit B6从而阻断Vit B6依赖的胱硫醚降解途径。这些代谢改变都可能与INH诱导的肝不良反应有关。目前的研究表明，药物代谢能够影响机体内部众多内生代谢途径从而增加肝损伤风险，药物代谢产物在这一过程中扮演着重要角色。

(二)代谢组学与新型抗结核药物开发

不良反应及耐多药结核病的产生需要研发新型抗结核药物。但过去50年仅有德拉马尼和贝达喹啉两种新型抗结核药物投入临床(我国还未广泛应用)，这远远不足以抵抗当前结核病的流行。

代谢组学能对体内药物的定量代谢速率和相关代谢产物进行监测，为药物优化提供依据，更好地指导抗菌素的设计和优化[40]。目前，代谢组学已具有监测异烟肼毒性的能力[41]。代谢组学还可用于诸多抗结核候选药物未知机制的探索。例如Koen等[42-43]通过GC×GC-TOF MS方法证实了硫酸黏杆菌素和多黏菌素E主要通过破坏MTB细胞壁产生杀菌作用。Baptista等[44]发现pretomanid(一种新型抗结核药)主要作用于磷酸戊糖途径，最终导致有毒甲基乙二醛的积累。代谢组学还是寻找和评估新型药物靶标的有力工具。例如Marshall等[45]基于NMR技术发现MTB细胞壁肽聚糖生成有关的D-丙氨酸途径的关键酶丙氨酸消旋酶(Alr)不适合作为新型抗结核药物的靶标，特定的Alr抑制剂也无杀菌效应。Prosser等[46]也提出，现有Alr抑制剂BCDA(β-氯-d-丙氨酸)真正的药物靶标是谷氨酸消旋酶(Murl)而非D-丙氨酸途径。除此之外，为了更早且更有效地开发新型药物，Zampieri等[47]开发了一种能对未知生物活性化合物的作用模式(MOAS)进行快速分类的系统性代谢分析策略，该策略能对生物活性化合物处理后的分枝杆菌的特异性代谢响应进行分析，以鉴定该化合物的MOAS，最终加快药物开发。

(三)代谢组学与抗结核药物治疗效果评估

抗结核药物治疗效果对患者预后及控制结核病传播十分重要。代谢组学研究发现，在不同时间点接受抗结核药物治疗的患者尿液代谢谱呈现出明显的治疗依赖性趋势，且痊愈的患者具有与健康患者相似的代谢特征[48]。结核病患者体内的某些特异性代谢物水平也会随着抗结核药物的治疗而下降[26]，表明代谢组学在结核病治疗效果评价方面具有巨大潜力。近来Luies等[49]基于GC×GC-TOF MS对21例治疗成功和10例治疗失败的结核病患者尿液代谢谱进行分析，鉴定了2种与肠道菌群失衡相关的代谢因子3,5-二羟基苯甲酸和3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸，二者可在诊疗之前预测一线抗结核药物治疗能否成功。 Zetola等[50]将电子鼻(传感器阵列)技术用于结核病诊断和治疗效果监测，通过将51例肺结核(31例为HIV阳性)患者在不同治疗时间点的呼吸标本与健康者呼吸标本进行检测分析，发现该方法区别结核病患者和健康者的敏感度与特异度分别为94.1%和90.0%，因为呼吸信号的改变是不同时间点观察到的，所以该实验表明其可以用于对抗结核药物治疗效果的监测。

结 语

技术突破是实现“终止全球结核病流行”的关键。代谢组学是一种高通量、高敏感度的新兴组学技术，能够通过对机体内源性代谢进行定量监测来直观地反映机体状态。该技术目前已被广泛应用于结核病的研究，并在某些方面开始与转录组学等技术进行联合研究。未来多组学技术联合研究是组学技术的发展方向。

目前，代谢组学在结核病领域的研究还存在诸多问题。例如，现行研究尚处于小样本范畴，已鉴定的诊断标记物等研究成果能否应用于临床尚需进行大样本研究来加以验证；代谢极易受到外界环境干扰，如何消除年龄、饮食等因素对代谢的影响是代谢组学面临的困难；由于技术限制，目前还无法将研究标本中的代谢产物完全呈现并进行完整的代谢信息分析。尽管如此，随着检测和分析技术的不断发展，代谢组学将极大地推动结核病防治领域的研究。