结核病分子病理学诊断技术临床应用进展

宋婧 车南颖

结核病(tuberculosis，TB)已经存在数千年，仍然是全球十大死因之一，死亡率在传染性疾病中排名第一，严重威胁人类健康[1]。病理学是诊断结核病的重要途径，尤其在痰菌阴性肺结核和肺外结核等疑难患者的诊断中发挥了重要作用[2]。传统的结核病病理学诊断主要依靠常规病理学及抗酸染色，可与其他常见的肿瘤和感染性疾病进行鉴别[3]；但与其他一些肉芽肿性疾病，例如非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)病的鉴别诊断中遇到很多困难。随着分子生物学与病理学的相互交叉渗透，20世纪70年代利用分子生物学技术研究疾病病因、发病机制、形态变化及功能损伤规律的新分支学科——分子病理学诞生[2]。近年来，分子病理学技术发展迅速；在2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》中提出，分子病理学检测是病理学确诊结核病的主要依据。分子病理学可以有效解决结核病与NTM病的鉴别诊断，以及耐药结核病的诊断等传统病理学所无法完成的难题[4]。笔者从分子病理学诊断结核病、NTM病及耐药结核病等3个方面对近几年分子病理学诊断技术在临床中的应用进展做一简要综述。

分子病理学诊断结核病

TB的早期诊断是临床治疗的关键，分子病理学技术是诊断TB快速、有效的方法。随着分子生物学技术的不断发展，新的PCR及其衍生技术的应用，进一步提高了TB病理学诊断的敏感度和特异度。

一、常用PCR技术

PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内将一个或几个结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)DNA拷贝扩增到百万数量级。为了提高PCR诊断的敏感度和特异度，基于普通PCR的新型分子诊断技术大量涌现。实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测实现对起始模板定性及定量的分析；巢式PCR通过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行2次PCR扩增，提高了微量靶序列检出的敏感度和特异度。董宇杰等[5]回顾性分析了胸腔镜活检获取的36例结核性胸膜炎患者福尔马林固定石蜡包埋组织标本(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)，25例经RT-qPCR检测MTB-DNA阳性，敏感度为69.4%，GeneXpert检测胸腔积液的敏感度仅为12.5%，活检组织MTB-DNA检测在结核性胸膜炎诊断中具有重要价值。穆晶等[6]分别用RT-qPCR与抗酸染色检测93例骨关节结核FFPE标本，RT-qPCR检测的敏感度(82.8%)明显高于抗酸染色法(68.8%)。McKew等[7]结合65 kDa(相对分子质量为65 000)热休克蛋白编码基因(65-kDa Heat Shock Protein Gene,hsp65 gene)和插入序列6110(IS6110)用RT-qPCR检测FFPE标本中的MTB，其敏感度(89%)优于新鲜组织固体培养(70%)。Seo等[8]对IS6110和MPB64序列设计引物用巢式PCR和RT-qPCR检测FFPE标本的MTB，巢式PCR的敏感度高于RT-qPCR，能够达到70%～87%，4种不同商业用试剂盒RT-qPCR阳性检出率为31.3%～80.0%不等。巢式PCR的缺点是2次扩增中间有开盖过程，存在污染风险，所以不适用于临床检测。RT-qPCR 只扩增1次，耗费时间短，且能对MTB起始模板进行定量分析，更适用于临床检测。

二、多重PCR技术

多重PCR技术是在同一个PCR反应体系中加入多对引物同时扩增DNA样本的几个不同靶区域片段，节约样本，省时省力。Fukumoto等[9]开发了一种同时检测病理组织标本中细菌和真菌的“多微生物实时PCR”诊断系统，能同时检测68种细菌和9种真菌。在10例获得性免疫缺陷综合征患者尸检时取肺部组织检测，金黄色葡萄球菌是最常见的微生物(8例)，其次是铜绿假单胞菌(6例)、肠球菌(6例)和白色念珠菌(4例)。此外，在1例肺炎中检测到MTB的潜伏感染。“多微生物实时PCR”诊断系统可用于检测病理标本中的细菌和真菌，有助于明确诊断感染性疾病。国内也有学者利用多重PCR技术检测TB患者FFPE组织标本，李子玲等[10]对结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65，hsp65)、IS6110和人类β2珠蛋白基因序列设计引物进行多重PCR扩增，结果显示出较高的敏感度和特异度，且可以鉴别MTB和NTM。

三、GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测技术

GeneXpert是由美国Cepheid公司开发的以半巢式实时荧光定量PCR技术为基础，系统自动运行并同时检测MTB和利福平耐药性的诊断平台。Polepole等[11]的研究评估了GeneXpert检测FFPE标本诊断肺外结核的准确性，以病理组织学诊断为标准，组织抗酸染色、PCR和GeneXpert诊断淋巴结结核的阳性率分别为13%(95%CI：5%～27%)、41%(95%CI：27%～57%)和30%(95%CI：18%～46%)；诊断淋巴结结核以外的其他肺外结核，阳性率分别为12%(95%CI：2%～38%)、82%(95%CI：56%～95%)和35%(95%CI：15%～61%)，PCR检测肺外结核FFPE标本的敏感度较GeneXpert更高。Pandey等[12]的研究表明GeneXpert对于大多数肺外结核新鲜组织标本和呼吸道(除痰外)标本的检测具有潜在价值，选取脑脊液、胸膜腔积液、淋巴结组织、脓液，以及支气管灌洗液等269份样本，以培养为标准，GeneXpert检测的敏感度和特异度分别为89%和95%；对于抗酸染色涂片阳性和涂片阴性样本，GeneXpert检测的敏感度分别为100%和77%，特异度分别为94%和96%。GeneXpert检测新鲜组织标本效果更好，可能与FFPE标本制作过程中，福尔马林固定液引起蛋白交联导致DNA损伤、蜡块组织保存时间过长等因素有关。

总之，分子生物学技术在结核病组织病理学诊断中的应用，大大提高了病理学诊断结核病的阳性率，在结核病的早期诊断中具有较好的临床实用价值。

分子病理学诊断NTM病

NTM是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌[13]。近年来， NTM从临床标本中的分离率有所增加。NTM病与TB的组织形态学相似，抗酸染色也很难区别，分子病理学实现了传统病理学无法完成的NTM感染的诊断。

一、多重PCR技术

目前共发现154种NTM和13个亚种，仅少部分对人体致病。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等器官，并可引起全身播散性疾病[13]。16S rRNA和16S-23S rRNA基因内转录间隔区(ITS)、rpoB、hsp65等基因序列常被用来鉴别MTB和NTM。Kim等[14]观察到MTB和NTM感染之间的组织形态学基本没有差别，用多重PCR和RT-qPCR两种MTB与NTM检测试剂盒检测154例分枝杆菌感染患者的FFPE肺组织标本，包括137例TB患者和17例NTM病患者(分枝杆菌培养结果为12例胞内分枝杆菌，2例脓肿分枝杆菌，1例鸟分枝杆菌，其余2例未鉴定出菌种)。多重PCR检测NTM的敏感度略高于RT-qPCR，但两种方法鉴别MTB与NTM差异无统计学意义。Sabeti等[15]报告的1例32岁患有终末期肾病的男性患者，手指病灶有皮下结节性病变，FFPE标本组织行抗酸染色涂片检查阳性，PCR检测结果为结核分枝杆菌复合群阴性，进一步用多重PCR鉴定出一种生长缓慢的NTM——M.haemophilum，该菌可在免疫功能低下的患者中引起皮下溃疡性或结节性病变。在患者标本抗酸染色涂片检查阳性、MTB-PCR检测结果阴性时，应考虑与NTM病的鉴别诊断。

二、核酸探针杂交技术

核酸探针杂交技术的原理是与探针具有一定同源性和互补性的待测核酸分子在一定的条件下，可与探针通过氢键形成双链分子。这种双链分子经过核素、荧光物质或生物素标记后，可通过放射自显影或显色反应检测出来[4]。德国Hain公司开发的以23S rRNA为靶基因鉴定NTM的试剂盒包括GenoType Mycobacterium CM和GenoType Mycobacterium AS，前者鉴定结核分枝杆菌复合群及常见的15种NTM，包括鸟胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等，后者用于鉴定临床少见的其他16 种致病NTM，如耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、胃分枝杆菌等[16]。国内深圳亚能生物公司开发的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒采用PCR-反向斑点杂交技术原理，试验膜条上共有22个NTM探针位点，标本与相对应探针杂交显色，即检测到相应的分枝杆菌。北京博奥生物有限公司研发的分枝杆菌菌种鉴定芯片可以识别17种 NTM，Zhu等[17]用该芯片检测150例MTB和67例 NTM临床培养分离菌株样本，生物芯片结果与16S rRNA测序结果一致；195例临床痰标本中，116(59%)例培养阳性和79(41%)例培养阴性，生物芯片成功检测到全部116例培养阳性样品，同时检测到1株培养阴性的MTB。Munkhdelger 等[18]报道利用PCR-反向斑点杂交技术在FFPE 标本中成功鉴定了多种NTM。核酸探针杂交技术较一般PCR具有更高的检测通量，一次实验可以检测多个基因位点，从而鉴别多种NTM。

三、熔解曲线法

熔解曲线法是一种PCR后产物分析技术，野生型基因有特定的熔解温度值(Tm)，而突变型基因因为DNA双链结合能力下降导致相应的Tm值下降。Tm值下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关，据此可以检测出突变型和野生型。熔解曲线主要分为高分辨熔解曲线和荧光探针熔解曲线两种方法。高分辨熔解曲线(high resolution melting，HRM)技术是PCR扩增技术与熔解曲线分析技术相结合，依靠高分辨温度检测PCR仪和新型饱和荧光染料制作熔解曲线实现基因序列分析的新技术[19]。Khosravi等[20]使用德国QIAGEN Type-it HRM PCR试剂盒检测98株分枝杆菌临床分离株，rpoBC操纵子进行实时PCR后进一步HRM分析，成功鉴定出88株(89.7%)分枝杆菌。Issa等[21]采用16S rRNA基因作为实时PCR中的靶标，进行HRM分析，区分出不同的分枝杆菌种类。基于探针的荧光熔解曲线分析(fluorescence melting curve analysis，FMCA)是将带有荧光标记的探针-靶序列杂交体热变性的温度制作熔解曲线。张俊仙等[22]以DNA直接测序法为对照，应用FMCA法分析22种分枝杆菌标准株和11种非分枝杆菌标准株，结果与标准株DNA测序一致，成功地建立了FMCA鉴定方法。初步鉴定32株分枝杆菌临床分离株的结果显示，30株(93.8%)快速鉴定到种，2株鉴定到分枝杆菌属，FMCA具有较高的敏感度。目前，熔解曲线法用于FFPE标本分枝杆菌鉴定的报道较少，未来还需做进一步的研究。

四、高通量测序

DNA测序技术近年在多个生物研究领域得到广泛应用，其优点是通量高、速度快及准确性高，但操作复杂及较高的成本限制了其在临床中的应用。Bao等[23]最近开发了一种使用16S rRNA PCR扩增和焦磷酸测序(PCR-Seq)快速检测和鉴别FFPE标本中抗酸菌(acid-fast bacterium，AFB)的方法，包括结核分枝杆菌复合群、NTM、诺卡菌属及其他的AFB，并进行了评估。116例FFPE标本抗酸染色涂片阳性，其中83例(72%)通过PCR-Seq鉴定出AFB类型，除识别出14例结核分枝杆菌复合群和3例麻风分枝杆菌外，还确定了另外19个AFB菌种。在过去的几十年中，NTM和其他AFB(如诺卡菌属)的感染逐渐上升，肺外组织FFPE标本中检测出结核分枝杆菌复合群和NTM等AFB显得越来越重要。

传统鉴定NTM的方法操作复杂，需要2～3个月时间，且在多数情况下无法获得明确的鉴定，可能会延误 NTM的诊断和治疗。分子生物学方法操作简单、快速，一次检测就可以获得菌种鉴定结果，对NTM病的早期诊断具有重要价值。

分子病理学诊断耐药结核病

根据2017年世界卫生组织的最新报告，2016年我国新发耐药结核病患者5.8万例，但发现并经实验室确诊的仅有1万余例[1]。传统的MTB药物敏感性试验(简称“药敏试验”)受生物安全、培养时间长等因素影响，不能满足临床快速诊断耐药结核病的需求。目前，具有生物安全要求级别低、检测时间短、敏感度较高等特点的耐药结核分子生物学诊断方法日益受到重视。

一、核酸探针杂交技术

目前研究发现，MTB耐药的主要机制是抗结核药物作用位点的靶基因突变，如利福平(RFP)的rpoB81 bp(密码子507～533)耐药决定区(rifampin resistance determing region，RRDR)、异烟肼(INH) 的KatG和inhA-mabA启动子基因突变等[24]。德国Hain公司的GenoType MTBDRplus试剂盒是世界卫生组织推荐的检测MTB耐药性的方法，能够可靠地检测与INH和RFP耐药相关的常见突变。Schaumburg等[25]从14例TB患者FFPE组织标本中提取DNA，同时与基于培养的药敏试验结果比较，评估核酸探针杂交技术检测MTB对RFP和INH的耐药性，结果显示出较好的一致性。国内谭景尹等[26]用PCR-膜芯片反向点杂交技术检测FFPE标本中MTB的耐药基因突变，在42例MTBIS6110基因阳性的标本中，检出INH基因突变2例，RFP或Sm耐药相关基因突变各1例，INH、RFP和EMB耐药相关基因同时突变1例，与测序结果基本相符。FFPE标本提取DNA检测INH和RFP耐药性，较基于培养的药敏试验检测周期短，早期即可为患者抗结核治疗药物的选择提供指导。Guo等[27]开发和评估了检测耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的快速生物芯片系统。快速生物芯片系统测定结果与DNA测序结果的一致率为100%。与传统药敏试验相比，对于RFP耐药性的检测，快速生物芯片系统检测临床分离株的一致率为91.8%，检测痰标本为94.6%；对于INH的耐药性检测，快速生物芯片系统检测临床分离株与传统药敏试验的一致率为70.2%，检测痰标本一致率为78.1%。整个生物芯片测定需要6 h，而作为结核分枝杆菌耐药检测金标准的表型药敏试验检测方法需要2～3个月。但国内外关于该方法的报道大多数是用痰或者培养物等标本，对FFPE标本进行检测的报道较少。

二、熔解曲线法

已有学者报道用熔解曲线法快速检测新鲜组织MTB培养分离株的耐药突变。Sharma等[28]用HRM在200例肺外结核患者新鲜组织培养分离菌株中检测到22例MDR-TB患者(11%)，3例(1.5%)单耐RFP患者，8例(4%)单耐INH患者。同时HRM直接从组织中鉴定出另外4例培养阴性的MDR-TB患者。HRM检测结果和测序的结果具有100%的一致性。Luo等[29-30]建立了荧光探针熔解曲线技术检测MDR-TB的系统，用临床分离株对一线抗结核药物和二线抗结核药物分别进行了验证，并将检测结果与测序结果比较，有较好的一致性。熔解曲线法操作简单，结果容易判读，在MTB药敏试验方面有较好的应用前景。

三、GeneXpert检测技术

GeneXpert检测技术针对rpoB81 bp RRDR设计引物和探针，检测是否发生RFP的耐药突变，是世界卫生组织推荐的快速诊断耐药结核病的方法。Polepole等[11]用GeneXpert 技术检测100例肺外结核患者的FFPE组织标本，包括淋巴结、腹部组织、滑膜组织、皮肤、睾丸组织等，检出2例对RFP耐药的淋巴结结核患者，1例对RFP耐药的男性睾丸结核，14例是否对RFP耐药不明确。Rindi等[31]用GeneXpert技术检测14例具有TB组织病理学特征的FFPE标本和8例无TB组织病理学特征的健康组织标本，14例MTB-DNA均为阳性且对RFP敏感，对照组中均未检测到MTB-DNA。总之，GeneXpert技术检测FFPE标本中的MTB-DNA对RFP是否耐药的报道较少，未来还需进行更多样本量的研究以评估其诊断效能。

四、高通量测序

目前，常用的MTB耐药基因检测技术的缺点是检测位点有限，不能一次检出对所有常用抗结核药物的MTB耐药基因突变。而高通量测序能够检测所有已知的耐药基因突变位点，也可以发现未知的耐药基因突变。一项大样本量多中心的研究结果显示[32]，与传统药敏试验结果比较，基因测序检测MTB临床分离株对RFP耐药的敏感度为91%(靶基因为rpoB)，检测对INH耐药的敏感度为86%(靶基因为katG，inhA-fabG启动子组合)，检测对PZA耐药的敏感度为54%(靶基因pncA)，检测对Ofx耐药的敏感度为85%(靶基因为gyrA和gyrB组合)，检测对Mfx耐药的敏感度为88%(靶基因为gyrA和gyrB组合)。基因测序可能成为监测MTB对抗结核药物是否有耐药性的重要工具。由于存在对技术人员要求高、检测设备昂贵的问题，高通量测序难以在短期内广泛用于临床对MDR-TB的检测。

早期诊断和及时进行规范治疗是耐药结核病防控的关键。目前，国内已有基于核酸探针杂交技术和荧光探针熔解曲线技术的耐药检测试剂盒可供临床使用，但总体上可检测的抗结核药物不够全面，且成本较高，需要进一步研究更经济、高效、准确的方法用于耐药结核病的诊断。