重视分子病理诊断新技术提高结核病病理学诊断水平

车南颖

中国是结核病高负担国家，在结核病诊断中面临很多问题。分析2018年WHO发布的全球结核病报告[1]，中国结核病诊断在以下3个方面需要继续加强：(1)肺结核细菌学确诊率低，仅为31%，远低于世界平均水平57%；(2)耐药结核病发现率低，不到20%耐多药或利福平耐药患者被发现；(3)肺外结核发现率低，全球报告的结核病患者中15%为肺外结核，但中国报告的肺外结核患者仅占5%。

病理学是诊断结核病的重要途径，在疑难性结核病，尤其在菌阴肺结核(痰涂片及培养阴性)及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。近年来，分子病理学新技术发展迅猛，结合传统病理学可以做到确诊结核病、鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病，以及诊断耐药结核病，为解决以上3个结核病诊断所遇到的突出问题提供了新的途径。如何将这些新技术应用到临床实际工作中，提高疑难性结核病的诊断水平是摆在我们面前的重要问题。

病理学诊断结核病的方法及标准

一、病理学诊断结核病的主要方法

病理学诊断结核病的主要方法包括常规病理学、特殊染色、免疫组织化学染色，以及分子病理学等。2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》[2](以下简称“《共识》”)，对上述4种方法的原理、特点及注意事项等做了详细的介绍。

1. 常规病理学：常规病理学通过大体和镜下观察组织细胞的病理形态学变化进行诊断，具有针对性强、准确性高等特点。对结核病与其他一些非肉芽肿性疾病(如肺结核与肺癌)的鉴别诊断具有很好的优势。但肉芽肿或坏死等结核病常见的病理改变亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中[3-4]，《共识》中明确指出常规病理学诊断手段不能作为诊断结核病的金标准，必须通过其他方法找到明确的结核病病原学依据方可确诊。

2. 特殊染色：特殊染色中，抗酸染色是病理科最为常用的查找抗酸杆菌的方法，对于诊断结核病有非常重要的作用。需要注意的是，抗酸染色无法鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，而且除了分枝杆菌外其他一些种属的细菌也可呈抗酸染色阳性[5]，因此抗酸染色阳性并不能确诊结核病，形态典型的情况下只能诊断分枝杆菌病。真菌病是除了分枝杆菌病以外最为常见的感染性肉芽肿性疾病。如果仅凭常规病理，有时这两类疾病容易误诊，因此《共识》建议将抗酸染色和真菌染色作为感染性肉芽肿性疾病鉴别的常规项目开展。真菌染色中六胺银(Grocott’s methenamine silver，GMS)染色和过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff stain，PAS染色)是最常用的识别真菌的染色方法[6]。

3. 免疫组织化学染色：免疫组织化学染色是病理科非常常见的技术，但在结核病诊断中应用不多，主要原因是没有可以应用于临床的商业化一抗。但最近的研究表明，免疫组织化学检查操作简便，阳性信号易于观察，不需要使用油镜，可以有效地提高检测敏感度和工作效率[7-8]。因此，《共识》建议未来开展更多的临床转化及评估研究。

4. 分子病理学：分子病理学诊断技术发展迅速。基于基因检测的分子病理学新技术具有准确、快捷等优点，可有效提高组织标本中结核分枝杆菌的检出率[9-10]，可帮助鉴别结核病与非结核分枝杆菌病[11]，还可以帮助诊断耐药结核病[12]，为结核病病理学精准诊断提供了更多的辅助手段。目前，临床上常用的技术有实时荧光定量PCR、核酸分子杂交技术，以及荧光PCR探针熔解曲线法等[2]。

二、 病理学诊断结核病的标准

2018年开始实施的新的《肺结核诊断》卫生行业标准[13]中首次将病理学作为确诊依据。这也进一步说明了病理学在结核病诊断中的重要地位。为了让临床医师更加了解结核病病理学诊断内涵，同时规范结核病病理学诊断报告，2017年发表的《共识》中明确规定了结核病病理学诊断标准[2]。根据中华医学会编著的《临床技术操作规范：病理学分册》所规定的病理学诊断基本类型，结核病诊断也分为4个级别：(1)Ⅰ类诊断属于明确诊断，主要有2个因素，即形态学符合并且找到结核分枝杆菌复合群病原学证据。(2)Ⅱ类诊断属于提示性诊断，即形态学符合，但是并没有明确的结核病病原学依据。(3)Ⅲ类诊断属于描述性诊断，病变组织或细胞不足以提示诊断为结核病，只能进行病变的形态描述。(4)Ⅳ类诊断为无法诊断[14]。

Ⅰ类诊断标准明确了在传统的形态学基础上必须要有病原学依据。如果仅有常规病理学或特殊染色结果，诊断级别只能到Ⅱ类，只有通过分子病理学或微生物学获得病原学依据，才能达到Ⅰ类诊断级别。没有应用分子病理学技术的病理科按照《共识》规定可以出具Ⅱ类及以下级别的病理诊断报告。《共识》建议有条件的病理科积极开展分子病理学诊断工作，以提高结核病病理学诊断水平。

结核病病理学诊断现状及存在问题

结核病病理学研究在19世纪80年代至20世纪50年代非常活跃。当时，结核病在全球的流行率高、死亡率高，受到医学界的重视。通过尸检和组织病理学方法，观察研究不同类型的结核病病理形态改变，提出了很多结核病发病机制及诊断相关的观点。但在1950年前后抗结核药物陆续出现，结核病的治疗逐渐转变为内科药物治疗模式，外科手术逐渐减少，能获取的人体组织标本越来越少，影响了依靠形态学的结核病组织病理学的研究。随着20世纪末，结核病卷土重来，尤其是耐药结核病等难治性结核病的出现，结核病诊治新技术的研究与开发再一次受到重视。近年来分子病理技术发展迅速，结合传统病理学，结核病病理学诊断从组织细胞学水平发展到生物大分子水平，其诊断敏感度和准确性都得到了显著的提高。同时，微创技术，如CT引导下的经皮肺穿刺、支气管活检及超声引导下的针吸活检等技术的发展，使得疑难性结核病患者可以通过安全、快速、方便的途径获得组织标本。因此，病理学在菌阴肺结核及肺外结核的确诊中发挥着越来越重要的作用[15]。

虽然分子病理技术发展迅速，但是结核病病理诊断目前多以传统的常规病理和抗酸染色手段为主，只有少数高级别医院在开展结核病分子病理学诊断工作。中国结核病病理学诊断面临着以下几个问题。

一、结核病专科医院病理科基础薄弱、人员紧缺

病理学主要研究疾病的原因，以及疾病发生、发展过程和预后，是连接基础医学与临床医学的桥梁，在医学诊断和研究中占有重要地位。但是，很多结核病专科医院没有重视病理学科的发展，普遍存在病理科人员紧缺、设备陈旧、学科发展滞后，以及科室设置不合理等问题。2015年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会(简称“国家卫计委”)发布的《病理专业医疗质量控制指标(2015年版)》[16]中明确指出，病理科每百张病床应至少配备1名病理医师和1名病理技师。但是，大多数专科医院都达不到此项标准。很多专科医院甚至没有病理科的设置，没有病理科医师。结核病专科医院亟需重视病理学科发展，重视人才培养，改善工作环境，更新仪器设备。

二、结核病分子病理学实验室缺乏专业化建设

近年来，分子病理学发展非常迅速，可以为病理学确诊结核病、鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病、诊断耐药结核病提供至关重要的依据。但是，除了少数几家大型结核病专科医院外，很多专科医院还没有开展结核病分子病理学诊断工作。

分子病理实验室的建设要求与传统病理实验室有很大区别，主要体现在3个方面：(1)建立符合标准的分子病理学实验室；(2)必须有掌握分子病理学基本知识的、具有开展PCR临床检测审核资质的专业医师及技术人员；(3)配备符合分子病理学实验要求的专业设备。场地、人员、设备是开展分子病理学诊断工作最基本的条件。因此，专科医院在病理科建设和发展中不仅应该重视传统病理学的发展，在条件允许的情况下也要考虑分子病理学的同步发展，应该在专业实验室建立、专业人才培养、专业化管理方面多做工作。

三、结核病病理学诊断的质量控制体系亟待完善

2004年《临床技术操作规范：病理学分册》[14]出版，是我国第一部病理科技术操作方面的规范，主要包括病理学检查常规、基本技术操作及相关技术操作。2009年中华人民共和国卫生部颁布了《病理科建设与管理指南(试行)》[17]，主要对执业条件、质量控制、安全管理、监督管理等方面做了规范。该指南在病理科场所、设施、设备及人员方面提出了明确的基本要求。2015年，国家卫生和计划生育委员会颁布了《病理专业医疗质量控制指标(2015年版)》(简称《质量控制指标》)[15]；其中包括了13项内容：每百张病床病理学医师数、每百张病床病理学技术人员数、标本规范化固定率、HE染色切片优良率、免疫组织化学染色切片优良率、术中快速病理学诊断及时率、组织病理学诊断及时率、细胞病理学诊断及时率、各项分子病理学诊断室内质量控制合格率、免疫组化染色室间质量评价合格率、各项分子病理学检查室间质量评价合格率、细胞病理学诊断质量控制符合率、术中快速诊断与石蜡诊断符合率。该《质量控制指标》贴近病理科日常工作，从人员配置，主要诊断工作的重要环节、技术要求及质量控制等方面做了明确的说明。同年，《分子病理诊断实验室建设指南(试行)》[18]发表，建议三级甲等医院病理科应设置分子病理学诊断实验室，并且在医院准入、人员准入、实验室设置要求、实验室生物安全、检测项目准入、质量保证和质量控制、试剂盒消耗品准入和管理、报告格式和内容、分子病理学诊断实验室管理等9个方面给出了指导性参考意见[18]。结核病专科医院病理科建设也应该按照上述指南和规范，做好病理科的各项质量控制工作。同时，应该发挥结核病专科医院的特点，在实际工作中建立具有结核病专业特色的质量控制体系。但是，目前无论是国家层面还是专科系统内都没有针对结核病病理学相关的质量控制标准。如抗酸染色、结核病分子病理学及结核病免疫组织化学染色等都需要进行室内质量控制和室间质量评价工作，但这些工作目前都存在严重不足。未来，结核病病理学需要建立健全的质量控制体系，以保证和提高结核病病理学诊断的质量，为结核病诊治与防控提供有力保障。

展 望

分子病理学作为结核病确诊的重要途径，可为难以获得细菌学证据的疑难性结核病的诊断提供结核分枝杆菌病原学依据，还可以提供病原菌的基因型药敏试验结果。随着“精准医学”理念的发展，结核病的诊治模式也在逐渐发生变化。目前，从传统经验医学的模式越来越多地采用循证医学观念，并向精准医学时代迈进。实现结核病的精准治疗，建立个体化的治疗方案是我们的愿景。分子病理学新技术的推广和普及，势必促进结核病诊断水平更上一层楼，成为结核病精准治疗不可或缺的诊断手段。未来，结核病病理学不仅要做好传统病理学的基础工作，还应该加快步伐推进分子病理学专业化建设、人才队伍建设，以及加快和完善质量控制体系建设，以适应结核病防治事业发展的需要。