慢性阻塞性肺疾病动物模型研究进展

蒋超文 陈琰 王斌

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的以持续呼吸系统症状和气流受限为特征的疾病，通常与有毒颗粒或气体的显著暴露引起的气道和/或肺泡异常有关[1-2]。2018年最新流行病学调查研究结果显示，我国COPD疾病负担非常重，总患病人数已达9 990万，约占全球COPD患者的25%，其中，20岁及以上成人COPD患病率为8.6%，40岁以上人群患病率则高达13.7%[3]。在全球范围内，COPD是第四大死亡原因，预计到2020年，COPD将会超越下呼吸道感染而成为仅次于缺血性心脏病和脑血管疾病的第三大死因，给全球公共卫生带来很大负担[4]。

为了研究COPD的发病机制和有效的临床治疗方法，国内外虽然进行了很多研究，但是取得的进展有限，目前仍未能完全阐明其发病机制。动物实验是研究COPD的重要手段和途径，虽然动物疾病模型只能模拟COPD的一部分特征，但是其确实可以提高我们对COPD生理、病理生理和治疗的基本机制的认识，建立稳定可靠的动物模型是实验成功的前提条件。本文就目前各种常用的COPD动物模型及其研究和应用综述如下。

一、实验动物的选择

大鼠、豚鼠、小鼠、小型猪、家兔、猴子以及犬是目前用于建立COPD模型的主要动物，其中，最常用的是大鼠和豚鼠。

1大鼠： 大鼠生命周期短，繁殖力强，性情较温驯，饲养繁殖成本较低，而且目前已经对大鼠基因组研究得很清楚。由于大鼠基因组与人类基因组非常相近，比较适合用于建立COPD动物模型。但应用大鼠建立COPD模型也有其局限性：①大鼠的肺分左右叶，左肺仅一叶，右肺4叶；②大鼠气管黏膜下的腺体无杯状细胞，支气管的分支少，这些特征与人类不太相符；③有研究表明，大鼠对烟熏诱导的COPD样损伤抵抗力较强等[5]。

2. 小鼠： 小鼠作为动物模型的优点与大鼠相似。其缺点主要包括：①因支气管和细支气管无杯状细胞及缺乏黏液下腺，导致滤过功能较低；②无呼吸性细支气管；③建立模型所需时间比较长，难以维持且评价肺功能困难，且损害程度存在品系差异[6]。

3. 小型猪： 小型猪目前被认为是较理想的用于建立COPD模型的动物。小型猪的肺分叶明显，结构与人类很相似，左侧2叶，右侧3叶，而且小型猪也有呼吸性支气管， COPD模型中气道阻力增加的最重要原因的就是这些小气道阻力的升高；小型猪的气道黏膜下腺体相对发达, 更容易感染，因此诱导COPD模型相对容易成功；此外，小型猪的气道直径较大，便于实验操作[7]。

4. 豚鼠： 豚鼠与大鼠相似。豚鼠的肺不仅在解剖学及生理学上与人类较为相似，而且对过敏原的反应也与人类有很多相似之处，因此也常被用于构建COPD 模型[8-16]。

5. 猴子： 猴子与人类同属灵长类动物，其肺组织结构和功能与人类最为接近，其病理生理、发病机制也与人类相似，因此，用猴子来复制COPD模型相比其他动物有独特的优势。猴子被认为是研究人类COPD发病机制的最合适做模型的动物[17]。其不足之处在于: ①体型偏大，实验操作较为困难；②购买、饲养、繁殖和药物使用的成本高；③生命周期长，繁殖速度慢，繁殖数量相对少，导致研究周期长[18]。

6. 犬： 犬暴露在香烟烟雾之后导致的慢性支气管炎和肺气肿的病理和病理生理学变化与人类较为相似，而其作为COPD动物模型的不足之处与猴子相似。目前犬已经被广泛用于建立支气管哮喘和COPD的动物模型[19]。研究证实，短时间内直接吸入香烟烟雾可使犬产生肺气肿和肺纤维化[20]。

二、建立COPD动物模型的常用方法

目前国内外建立COPD动物模型的方法主要是通过将实验动物暴露于蛋白水解酶、香烟烟雾、炎症刺激物(如LPS)和基因调控来诱导产生。

1. 蛋白水解酶诱导的COPD模型： 研究表明，蛋白酶-抗蛋白酶失衡是引起COPD病理类型中肺气肿的主要原因。在被确诊为α1抗胰蛋白酶缺乏症的患者中，大部分患者同时患有肺气肿[21]。这一发现是肺气肿胰蛋白酶-抗胰蛋白酶假说的基石。当肺内蛋白酶负荷超过抗蛋白酶时，弹性蛋白酶被降解，最终导致肺气肿的发生[22]。后续的研究则进一步证明，向啮齿动物大鼠气管注入弹性蛋白酶可诱导其再现肺气肿的主要病理特征[23]。常用的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶等。

毛旻等[24]把10只小型猪随机分为模型组(n= 6)和对照组(n=4)，模型组采用气管内注入木瓜蛋白酶的方法复制肺气肿模型。实验方法具体如下：麻醉小型猪后行气管插管，测定各组肺功能、血气、电子计算机断层扫描(computed tomography, CT)，模型组支气管镜下左肺叶内注入5 ml(6 U/kg)木瓜蛋白酶，对照组支气管内注入5 ml生理盐水，每周1次，于第五周测定各组肺功能、分析血气、检测并评估左右肺叶的CT值，最后对比分析两组小型猪血气、肺功能、CT值的情况。实验结果证明小型猪支气管镜下左肺叶内注入木瓜蛋白酶能成功复制猪肺气肿模型。

采用蛋白水解酶诱导COPD模型这种方法的主要优点是我们可以通过调整蛋白水解酶的灌注剂量来控制COPD的严重程度，缺点则是弹性蛋白酶在COPD中的作用依赖于多种病理生理机制，从而增加了临床事件的数量[25-27]。

2. 烟雾吸入诱导的COPD模型： 吸烟已被公认是COPD的最主要的病因。大鼠、小鼠和豚鼠等都可以用烟雾吸入诱导COPD模型的建立。曹君等[28]把20只C57BL/6J小鼠置于自制熏烟箱进行烟熏，每天烟熏4次，每次6支香烟烟熏15 min， 持续90 d，最后成功建立了肺气肿模型。该COPD模型稳定可靠，其病理学改变与人类COPD相似。

烟雾吸入法诱导的COPD模型具有COPD的许多疾病特征，包括肺内巨噬细胞、中性粒细胞浸润、气道纤维化以及肺气肿，但是不同动物种类或者同种动物不同品系对香烟烟雾的敏感程度不一，而目前还没有标准的动物暴露方法[29-31]。

3. 内毒素诱导的COPD 模型： 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 存在于革兰阴性菌中，可以诱发气道慢性炎症，通过对模型动物气道内反复滴注LPS可构建COPD动物模型。Stolk等[32]通过向金黄地鼠气管内反复滴入LPS成功建立了LPS诱导的COPD模型，并推断肺气肿形成的重要原因是LPS引起的中性粒细胞聚集及蛋白酶释放。该研究发现，反复滴入LPS 8周后即可观察到肺气肿形成。此外，另有多项研究也成功的应用LPS诱导了其他鼠类COPD模型[33-35]。

COPD 是一种慢性的病理过程，由气道炎症到气道重塑，逐步导致持续性通气功能障碍，而LPS诱导的肺气肿是在短时间内造成肺及气管的损伤,所以LPS诱导的肺气肿只是复制出COPD的部分特征[7]。

4. 基因调控的COPD 模型： COPD是一种多基因病，遗传易感性是其重要的危险因素。通过对动物某一特定基因进行调控的方法来建立 COPD 模型是近年来兴起的一种新方法。Iizuka等[36]采用烟雾吸入法成功在Nrf2-/-小鼠中诱导出COPD模型。Churg等[37]将肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)敲除小鼠(TNF-αR-/-)长期暴露于烟雾后成功复制了COPD小鼠模型。

α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)缺乏是COPD最常见的遗传因素， 人类只有一个编码α-1抗胰蛋白酶的基因，而小鼠有6个，所以建立AAT缺乏症相关COPD小鼠模型非常困难。 Borel等[38]最近成功地运用第三代基因编辑技术(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技术创建了这种小鼠COPD模型。

基因调控的COPD动物模型为研究者提供了一个新的方向，将会有越来越多的研究采用基因调控的动物模型来研究COPD的发病机制。

5. 其他方法诱导的COPD模型： 由于COPD发病机制尚未完全阐明，发病过程较为复杂，目前尚无统一的、公认的COPD动物模型建立方法。为了尽可能真实地模拟COPD 的发病过程，许多研究者采用多因素联合诱导COPD动物模型。比较常用的是LPS经气管内注入加香烟烟熏法。宋小莲等[39]将24只8周龄Wistar大鼠随机分成3组，每组8只。其中1组作健康对照，另2组分别进行单纯香烟烟熏和香烟烟熏加气道内注入LPS两种方法建立COPD模型。结果发现，虽然两种方法都可以成功建立大鼠COPD模型，但是采用香烟烟熏加气道内注入LPS方法建立的大鼠COPD模型病理生理改变与人类COPD特征更为相似。此外，还有气道内注入LPS和促弹性蛋白酶以及气管内滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法等其他建模方法。

三、展望

COPD发病机制十分复杂，建立稳定可靠的动物模型是研究COPD发病机制的重要基础和前提条件。而在COPD动物模型构建中，单因素诱导的模型有许多方面不太符合人类COPD发病过程和病理生理改变，所以采用复合因素诱导的动物模型越来越多。随着COPD动物模型的发展和新的研究方法的建立，研究者在COPD的发病机制及其治疗方法的研究中一定会取得更大的进展 。