未折叠蛋白反应与肺部疾病关系的研究进展

唐为安 徐兴祥 杨俊俊

肺与外界直接接触，外界刺激如粉尘、气体、微生物容易导致肺内细胞产生大量错误合成蛋白，此时为保持细胞内蛋白平衡，内质网产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)促进错误蛋白进行正确折叠并降解无法折叠的蛋白，短暂的ERS有助于细胞恢复稳态，但是长期和高强度的ERS可以导致肺部许多疾病的发生。未折叠蛋白反应(unfold protein response, UPR)是ERS最主要的反应，主要分为三个途径：醇需要型跨膜激酶1(inositol needs transmembrane kinase 1, IRE1)、双链RNA激活蛋白激酶样ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、激活转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)，三种通路相互补充又相互制衡[1]。研究UPR和肺部疾病的联系，有利于更好地了解肺部疾病，本文现就UPR与肺癌、肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺纤维化的联系进行综述。

一、UPR与肺癌

肺癌是威胁人类的第一大肿瘤，肺癌细胞常常面对极端环境如缺血、缺氧、新陈代谢改变，为了应对这些极端因素细胞自身也产生相应的变化，引起UPR通路激活。细胞为满足快速分裂的需要，不断合成大量新的蛋白，容易导致错误蛋白大量积蓄引起细胞UPR，UPR的产生也有助于肿瘤细胞在极端环境的存活。

1. 大细胞癌： 大细胞肺癌属于非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)的一种，其调节机制与UPR通路的激活有关。Ahmadi等[2]发现UPR中的反应标志物GRP78对大细胞肺癌的调节十分重要，通过PCR检测发现在大细胞肺癌患者的肿瘤组织中，UPR激活标志物GRP78的表达是阴性对照的三倍以上，miR-495和miR-199a-5p都能够促进肿瘤细胞的恶性转变，在细胞中增高的GRP78能下调NSCLC中miR-495和miR-199a-5p，过表达或者抑制miR-495和miR-199a-5p也能够显著改变GRP78的表达和XBP1水平，可见UPR和microRNA互相影响共同促进癌症的发生。顺铂是治疗肺癌最经典的化学治疗药物之一，然而癌症耐药性的存在降低其疗效，研究发现中度UPR能够加强肺肿瘤的生长和转移，并增加肺肿瘤细胞的耐药性。Shi等[3]通过在铂类化疗药处理24h后的大细胞肺癌细胞H460中，加入ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)或牛磺熊去氧胆酸钠(tauroursodeoxycholate, TUDC)，通过MTT实验发现细胞活力大大下降，细胞内caspase-3基因和胞浆内细胞色素C明显上调，并极大的促进了细胞的凋亡，证实了化疗药物可以导致UPR的激活并增强肿瘤细胞的耐药性，其机制可能是细胞中PERK和IRE1均发生了磷酸化，导致细胞对于蛋白处理能力上升有关。

2. 腺癌： 腺癌大多起源其小支气管，早期无明显临床表现，其发生往往伴随着UPR通路的激活。Yang等[4]发现在2D培养和3D培养中肺腺癌细胞中能诱导转录因子XBP1的高表达，促进体外3D培养中肺腺癌细胞的增殖，通过敲除在XBP1表达可以阻断Tm/Tg诱导的细胞增殖，同时LOX基因作为是XBP1的关键下游效应物，敲低LOX表达可阻断XBP1诱导的细胞增殖，可见XBP1可以通过LOX调节肺腺癌细胞的增殖。贝伐珠单抗广泛应用于中晚期肿瘤的临床一线治疗，其机制主要是抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)来治疗肺癌，有研究显示贝伐珠单抗能够通过利用UPR的凋亡机制促进肺癌细胞的死亡，提高治疗效率。Wang等[5]发现随着贝伐珠单抗的浓度增加，其UPR凋亡基因CHOP表达成正比升高，贝伐珠单抗可能通过加剧UPR反应来促进A549细胞凋亡。来自海星的细胞生长抑制剂海星皂甙1具有多种生物活性，其抗肿瘤的机制也很可能与UPR激活有关。Zhao等[6]发现海星皂甙1增加ER扩张和胞质Ca2+浓度，并以剂量和时间依赖的方式增强UPR标记物GRP78和GRP94的表达，增加了CHOP、caspase-4和JNK三种基本的UPR相关凋亡分子表达，最终抑制A549细胞的增殖并促进细胞凋亡。

3. 肺癌免疫监控： 研究发现UPR通路有帮助肿瘤细胞逃避免疫监控。髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)常常在机体中起到免疫抑制的作用，MDSC能够直接抑制NK细胞也能够抑制CD4+和CD8+细胞介导的免疫反应。研究显示MDSC活性的激活与其细胞内部UPR通路激活密切相关。Cubillos等[7]发现MDSC中UPR的激活可以直接发生在应激的肿瘤微环境中，也可以从相邻发生UPR的癌细胞传播，UPR通路激活的MDSC能够抑制免疫细胞对肺癌细胞的攻击，通过抑制MDSC中ER应激传感器和UPR质可以将MDSC重编程，促使其成为保护性抗肿瘤免疫的细胞。预防UPR反应的抑制剂如TUDCA和4-PBA已经在临床前癌症模型中显示出有希望的治疗效果，通过抑制MDSK中UPR通路激活可以成为癌症免疫疗法的新干预措施。

二、UPR与肺部感染

肺部感染是肺部最常见的一类疾病，UPR信号在感染导致的炎症因子分泌中具有重要作用。由于炎症细胞往往具有大分泌需求，因此特别依赖于发育良好且大量的内质网，感染导致的刺激可能诱发细胞内的UPR反应。炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-6也可以引起纤维肉瘤细胞中UPR三条通路激活，从而引起肺部炎症的急性期反应，UPR激活与感染互相促进又互相拮抗[8]。

1. 急性肺炎： 急性肺炎反应的病因有很多种，其中急性肺损伤是其中重要的一个原因。在急性肺损伤导致的急性肺炎中，UPR通路激活对细胞自噬以及凋亡起到了重要的作用。Zeng等[9]为了鉴定脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的急性肺损伤小鼠模型中肺部炎症的细胞机制，通过添加经典UPR抑制剂4-PBA观察对UPR和自噬的影响，在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型和人肺泡上皮细胞模型中，4-PBA阻止了NF-κB通路的活化，降低了促炎介质TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，4-PBA通过抑制UPR通路减轻了炎症的激活，其机制很可能与PERK-eIF2α介导的翻译减缓促进炎症通路NF-κB的激活有关，表明UPR是LPS诱导炎症的关键启动子。4-PBA导致细胞自噬降低，其通过经典的AKT/mTOR信号通路在急性肺炎中起保护作用，通过细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)加剧了LPS诱导的A549细胞毒性，可见4-PBA抑制急性肺炎模型中UPR激活和自噬产生保护作用。UPR可以刺激NF-κB通路的激活，导致游离NF-κB可转位到细胞核中，其机制可能是IRE1α自磷酸化诱导其细胞质区域发生构象变化，与衔接蛋白TNF-α受体相关因子2结合，IREα-TRAF2复合物招募IκB激酶并磷酸化IκB，导致IκB发生降解和NF-κB核转位[10]。

2. ABPA： 烟曲霉(aspergillus fumigatus, AF)的致敏作用与严重过敏性肺部炎症有关，过敏性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)就是过敏性真菌病中最为常见的一种疾病。临床研究发现过敏性支气管肺曲霉病患者的肺组织中葡萄糖调节蛋白GRP78增加。Lee等[11]发现UPR与AF患者转导通路之间存在联系，使用Af暴露小鼠显示肺中UPR相关蛋白GRP78表达大量升高，线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mtROS)大量产生，施用UPR抑制剂改善了AF诱导的过敏性炎症，可见UPR在AF诱导的过敏性肺部炎症中被激活，敲除磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K-δ)也能够抑制UPR的激活，并且减少mtROS的产生和气道的高反应性，在原代培养的气管上皮细胞中，也可以通过阻断PI3K-δ抑制AF诱导的UPR反应。这些发现表明PI3K-δ通过UPR调节AF诱导的过敏性支气管肺曲霉病，可见UPR是ABPA产生的一个关键步骤。

三、UPR与肺纤维化

肺纤维化是以炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病，是由正常组织修复过度导致了成纤维细胞大量增生，细胞外基质异常堆积造成的。细胞激活UPR信号通路以维持内质网稳态，但是UPR同时也是一把双刃剑，短时间UPR虽然有利于维持细胞蛋白平衡，当UPR时间过长或刺激太强后，能够导致肺部细胞功能受损甚至凋亡。

1. IPF： 常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型为特发性肺纤维化(idiopathic fibrosis of the lung, IPF)，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病，目前病因不明。肺实质中有许多细胞包括肺泡上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等都在IPF发展的过程通过UPR产生影响。肺泡内的细胞主要分为Ⅰ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cellsⅠ, AECⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cellsⅡ, AECⅡ)，Ⅱ型肺泡上皮细胞是维持肺泡完整性所需的祖细胞群，AECⅡ功能丧失和凋亡被认为是IPF初始阶段和发展的重要过程[12]。KORFEI等[13]从IPF、COPD和正常器官供体三组患者外周移植肺组织取样分析，通过蛋白检测发现IPF中的AECⅡ能够产生大量的ATF-6、ATF-4和CHOP等UPR相关蛋白，但在COPD和正常器官供体中不存在，可见在IPF患者中UPR激活可以导致处于纤维化部位内面的肺泡II型上皮细胞自我凋亡并被纤维组织取代。Kropski等[14]通过表达突变表型活性蛋白C或者衣霉素诱导UPR激活，使得博来霉素诱导的IPF小鼠模型中AEC死亡和肺纤维化增强，可见UPR激活可能会使AEC脆弱性增高，导致肺部损伤增强和IPF发生。UPR虽然不能直接促进IPF的发生，但是可以提高患者IPF发病的概率。Lawson等[15]通过在小鼠的AECⅡ表面活性蛋白C上过表达L188Q，6个月后发现UPR通路被激活，虽然并没有导致肺部纤维化的发生，但这些小鼠被博莱霉素刺激后，表现出更强的肺纤维化能力和细胞凋亡能力，证明UPR通路的激活并不足以激活肺部纤维化，但是对于IPF的发生具有重要作用。在许多IPF患者中，人们发现疱疹病毒与IPF的发生密切相关。疱疹病毒经常在IPF肺中发现并且可以诱导UPR。Lawson等[16]在23例IPF患者的AEC中发现疱疹病毒蛋白表达，并且发现孢疹病毒蛋白和UPR标记共定位，疱疹病毒感染也可以直接促进UPR激活，使得患者存在免疫功能下降诱导恶性肺纤维化和IPF发生。

2. CF： 囊性肺纤维化(cystic fibrosis, CF)患者的气道表现出持续强烈的炎症反应，肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AMs)在CF患者的的发病机制中起关键作用，部分AMs细胞可以分泌大量炎性介质如诱导TNF-α和IL-6的产生。UPR中XBP1被IRE1通路信使RNA剪接后影响外周巨噬细胞，产生炎症作用。Lubamba等[17]发现CF患者AMs中UPR通路激活XBP1表达大量增加，同时发现LPS与UPR通路中转录因子XBP-1的水平升高相联系，在培养的dTHP-1细胞中敲除XBP-1降低了CF患者的炎症反应，可见CF患者中的炎症因子可以由UPR中的XBP-1表达调控，CF患者中AMs通过上调XBP-1介导的细胞因子促进对CF患者气道的炎症的发生。

四、UPR与慢性阻塞性肺气肿

虽然UPR导致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的功能目前尚不明确，但是研究发现在COPD患者的细胞中发现了UPR通路激活的现象[18]。COPD常与吸烟相关，吸烟暴露会损害蛋白酶体本身，导致大量不溶解蛋白在气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和巨噬细胞中大量积聚，引起细胞产生UPR。

1. 慢性支气管炎症： 慢性支气管炎患者粘液细胞增多，常常分泌大量粘液。气道杯状细胞的IRE1β对于粘液细胞表型和分泌粘液素5AC(mucin5AC，MUC5AC)和粘液素5B(mucin5B，MUC5B)具有重要作用。研究表明低氧刺激可以激活分子伴侣GRP78的解离，激活UPR修复细胞的蛋白酶和自噬功能。Min等[19]发现磷酸化的eIF2α和chop蛋白在COPD患者的肺组织中表达升高，然而IRE1和ATF6通路则没有发现明显的变化，磷酸化的eIF2α和chop蛋白改变对于气道的阻塞具有直接关系。然而并不是每一个COPD患者都会出现UPR通路的激活，Tran等?[20]在COPD患者检查中并未发现UPR通路信号分子GRP78、XBP1、CHOP等蛋白表达升高，意味着仅在一部分COPD人群中，UPR通路被激活。囊性纤维化跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是氯通道和上皮功能的关键调节因子，气道中CFTR功能的丧失会导致粘液增厚，减少粘膜纤毛清除，慢性感染和呼吸衰竭。UPR在转录、翻译和成熟水平能够降低CFTR表达，UPR引发ATF6与CFTR的最小启动子的结合导致CFTR转录被抑制，并对对组蛋白脱乙酰化和启动子甲基化，降低CFTR的表达[21]。

2. Nrf2： 抗氧化核因子E2相关因子2(antioxidant nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)：Nrf2缺乏和UPR激活常常存在于严重的COPD中，NrF2与UPR互相拮抗。研究报道PC12细胞UPR激活时上调Nrf2介导的血红素加氧酶(haem oxygenase, HO)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)表达增加，HO和GCLC又会导致COPD的病情加重[22]。Nrf2与UPR在COPD患者中的作用相互影响，实验发现抑制Nrf2信号通路能够明显减弱COPD患者和暴露在吸烟环境中的小鼠UPR激活，并且提高了机体对于低氧的抵抗[23]。虽然Nrf2能够提高UPR的表达，但是Anna等[24]采集COPD患者和非COPD患者的外周血单核细胞，进行实验发现Nrf2的表达量在COPD患者中大量升高，UPR通路未有明显变化，这可能与COPD患者的病情程度有关。

五、UPR与哮喘

支气管哮喘是一种伴有气道反应性升高的慢性炎症，长期的炎症、低氧等因素的刺激容易导致UPR的激活，并与气道炎症反应互相协同[25]。气道上皮细胞内钙离子浓度、透明质酸、粘蛋白分泌等因素都受到UPR的调节作用。

1. 哮喘： 目前认为在支气管哮喘发病机制中，UPR与气道上皮细胞的透明质酸与黏蛋白的异常分泌、钙稳态失调、炎症细胞趋化等环节都密切相关。Kim等[26]通过对哮喘患者的外周血单核细胞和支气管肺泡灌洗液检测，发现UPR标识蛋白GRP78表达显著升高，UPR通路很可能通过激活NF-κB导致哮喘的发生。UPR除了直接影响肺泡细胞，还能够刺激免疫细胞的活性。Zhang等[27]研究发现，用姜黄色素处理的T细胞可诱发UPR中PERK和IRE1通路激活，引起CD4+淋巴细胞和T淋巴细胞中刺激转录因子XBP-1和CHOP上调，最终引起T细胞的凋亡。在哮喘患者的气管上皮细胞中，辅助性T细胞2型(Helper T cells2，Th2)可以分泌IL-4和IL-13导致ATF6上调，而ATF6则提升了内质网钙泵活力与SERCA2b基因表达，最终影响气管平滑肌细胞的增殖与重塑，刺激哮喘症状加重[28]。

2. ORMDL3： 血清类黏蛋白1样蛋白质3(serum mucin 1 like protein 3, ORMDL3)ORMDL3在哮喘的发病机制中属于关键基因，能够调节细胞内钙离子浓度和UPR的激活。Moffatte等[29]证明ORMDL3基因影响UPR并导致哮喘发生，ORMDL3基因通过调控肌浆中钙离子通道导致磷酸化eIF2α减少，而钙离子ATP泵的减弱又能够引起气道的重塑和高反应性，这是哮喘发病机制的标志之一。Cantero等[30]发现ORMDL3表达增加UPR反应，UPR的效应基因及相关信号通路均明显上调，如使用敲除ORMDL3基因后内质网释放钙内流的离子减少，UPR作用也相应减弱。由于哮喘患者中ORMDL3基因的表达增高，其机制很可能是通过调剂UPR通路影响钙离子浓度造成的。

综上所述，UPR是细胞对于自身蛋白控制的一种途径，能够针对外界刺激产生的差错调节细胞内稳态，并影响体内细胞自噬和凋亡途径。UPR影响肺部疾病的范围十分广泛，不仅仅与上述几种肺部疾病有关，临床发现UPR还影响肺部急性损伤、肺缺血再灌注损伤等疾病。然而目前UPR对于肺部疾病的发病机制并没有完全查明，仍然需要大量的研究。了解UPR与肺疾病发病机制的联系，有助于为未来的肺部疾病的诊断治疗治疗提供新思路。