早期肺癌检测的研究进展

任丽丽 金发光 刘小北

肺癌(carcinoma of the lungs)是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，在世界范围内，肺癌的患病率和病死率都居首位[1-2]。调查结果显示，2015年国内肺癌的发病数为733 300例，死亡数为610 200例[3]，2015年，全球新增肺癌患者1 987 909例，因肺癌死亡者多达1 732 185例[4-5]。从上述两组数据表明，肺癌的患病率和病死率非常接近。尽管医学界对肺癌进行了病因学研究及肿瘤遗传学调查，而且对肺癌的诊断及治疗等方面进行了不少改进，但在过去数十年间，肺癌病死率仍急速攀升，而总体生存率仍然相当低。我国肺癌5年生存率仅为16.1%[6]，世界范围内肺癌5年生存率也仅为18.1%[7]。造成肺癌患者生存率低与不良预后的原因，主要是大多数的肺癌患者在发现症状时都已经到了晚期，肿瘤已经转移。研究表明早期肺癌，如中央鳞状细胞原位癌(central squamous cell carcinoma in situ)和腺体原位癌(adenocarcinoma in situ)却预后良好[7-8]。对早期肺癌的筛查与检测是改善肺癌生存率的关键，现就肺癌的早期检测研究进展作一综述。

一、血清肿瘤标志物检测用于肺癌早期诊断

血清肿瘤标志物是广泛存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。目前较为确定的，在临床中常用的肺癌标志物包括：①癌胚抗原(carcinoembryomic antigen, CEA)，CEA是在肺癌检测中较为常用的肿瘤标志物，大量研究证明CEA升高有助于肺腺癌的诊断，以及CEA升高与肿瘤病理学类型相关和临床分期呈正相关[5，8]；②神经特异性烯化酶(neur-specific enylase, NSE)，又被称为烯醇酶(enolase)或γ-烯醇酶(γ-enolase)，检测血清NSE水平可以协助诊断小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，同时血清NSE水平可用于SCLC的分期及预后判断[9-10]；③细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragments, CYERA 21-1)是由多种上皮细胞和癌上皮细胞分泌产生，在肺癌组织中，CYFRA 21-1含量增高，尤其是在肺鳞癌中有高表达，研究发现转移性肺癌化疗前的血清样本，CYFRA 21-1高的患者预后不良[11]。鳞癌患者的血清CYFRA 21-1水平显著增高，CYFRA 21-1对NSCLC的敏感性为59.6%，特异性为90.5%[12]；④表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是最重要的分子生物肿瘤标志物之一，特别是对基因突变预测及肺癌靶向治疗的疗效判断，早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)肿瘤组织及淋巴组织存在EGFR高表达，通过与hTERT结合，EGFR mRNA即成为诊断与评估肺癌临床分期的生物标志物[13]。

肺癌肿瘤标志物在不同的个体中差异很大，这主要是肺癌的病理类型对肿瘤标志物的变化具有很大的影响，同时还受到技术条件的限制，在肺癌患者中检测的敏感性和特异性尚有一定的局限性。如何将分子生物学的技术用于肺癌早期诊断，提高早期肺癌的检出率是当前研究的热点之一。通过寻找和应用有效的筛选方法，有望提高肺癌的早期诊断，现已发现，核内不均一核糖核蛋白(heterogenous nuclear ribnucleoprotein, hnRNP)，该物质为存在于细胞核的一种RNA结合蛋白，被认为是有效的标志物。研究证实肺癌细胞株和手术切除的肺癌组织均有表达，而正常的支气管上皮和肺泡上皮细胞的细胞核则没有hnRNA蛋白表达，FHIT基因微卫星缺失、端粒酶和DNA的甲基化等。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测与新的敏感基因检测技术结合对痰液、支气管肺泡灌洗液(broncholveolar lavage fluid, BALF)和血液肿瘤标志物进行检测，也为肺癌早期诊断提供了依据[14]。

二、影像学检查用于肺癌早期诊断

1. 低剂量螺旋CT扫描： 低剂量螺旋CT(low-olose computed tomography, LDCT)具有常规CT的敏感性，但是射线辐射剂量较常规CT要低很多。一次常规胸部扫描辐射量为3～27 mSv，是胸部X线片10～100倍，而LDCT扫描辐射剂量仅为常规CT的26%，显著降低了受检查者的辐射剂量[15-16]，对肺内小结节的检出率是常规X线胸片的10倍[2]。研究证明，LDCT在肺癌高危人群进行肺癌筛查能降低20%的肺癌死亡，因此，是肺癌的早期诊断和早期治疗、提高肺癌患者的生存率，降低病死率的重要措施[3，17]。一组研究对817例吸烟者进行LDCT检查，发现了肺癌18例[18]，另一组研究发现，LDCT筛查组中肺癌年病死率为247/10万，而X线筛查组中肺癌年病死率高达309/10万[17]，研究结果发现LDCT较X线胸片有更高的早期癌检出率，可显著提高肺癌的生存率[18]。

当临床上进行LDCT检查发现肺部结节时，应详细描述结节所在肺内的部位、结节大小、密度、钙化和形态。既往有影像检查结果者需与进行比较。如果发现肺部结节无法进行确诊的患者，应进行观察随访，随访频率和持续时间，应根据结节大小和其性质以及是否肺癌高危人群等因素，对于没有肺癌高危因素而有可能手术的患者，LDCT随访的频率应以结节大小而定[14]：结节直径≤4.0 mm者，每年进行一次LDCT随访；结节直径4.0 mm～6.0 mm者，12个月内对肺结节重新评估，如果结节没有变化，以后每年进行一次LDCT随访；结节直径6.0 mm～8.0 mm者，6个月至1年内进行一次LDCT随访，如果结节仍然没有变化，18个月至2年内再进一次LDCT检查，以后每年进行一次LDCT检查；结节直径>8.0 mm者，如果结节还没有变化，则采用传统的随访频率，即每3个月、6个月、12个月和24个月各进行一次随访，以后每年根据结节变化情况进行随访。

2. 正电子发射计算机断层扫描： 正电子发射计算机断层扫描(positrom emission computed tomography, PET/CT)是核医学发展的一项新技术，PET/CT是同机具有多层螺旋CT和PET的图像融合设备。PET/CT是一项医学影像学的革命技术，是一项在肺癌筛查及全身其他脏器肿瘤筛查和诊断中常用的重要检查，其对癌症的诊断具有重要作用，尤其在肺癌的诊断、分期以及疗效评价方面，具有较高的敏感性及特异性[19]。其特点是PET能提供病灶功能与代谢等分子信息和CT能提示病灶解剖定位，以其两者结合等优点，能够早期、快速、准确地发现肿瘤，并且能够确定肿瘤的性质，与常规CT检查比较，其对肺结节特性检查的敏感及准确性均较高。但由于示踪剂18F-氟代脱氧葡萄糖(fluordeoxyglucose,18F-FDG)的代谢特点，有一定的假阴性和假阳性。近年来，新型示踪剂18F-氟代胸苷(18F-fluoro thymidylic,18F-FLT)极大地提高了肺癌早期诊断的准确率[20]。因此，18F-FLT对肺癌诊断的特异性明显高于18F-FDG。另外，还有多种特殊示踪剂单独或联合使用有望进一步提高肺癌早期诊断的准确性。

3. PET-磁共振成像： PET-磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是两者融合一体的新型大型影像诊断设备，是功能影像与分子影像学发展的最前沿技术之一，并具备PET和MRI的检查功能，可实现解剖与功能影像最大程度的优势互补[21]。其中MRI可提供清晰的解剖定位、优良的软组织对比、清晰的波谱功能信息、更高的对比分辨率和血流动态图像，其对肺部、纵隔、胸壁等部位病变判断有较大优势[22]。PET-MR是随着科学技术的进步和临床与科研的需要应运而生，目前PET-MR的临床应用主要是集中在肿瘤、心脏疾病及脑神经科学等领域中[23-24]。PET-MR可用于认知损害疾病的早期诊断，并可对其病因进行鉴别诊断，特别是对肿瘤的诊断与分期、疗效的评价等具有应用价值。随着核素快速标记技术、分子生物、核化学和分子药理学的快速发展，PET-MR显像剂的研发将取得长足的进步，并将逐渐应用到细胞代谢、细胞受体、细胞衰老和细胞凋亡，以及核酸和基因等领域，可以预见PET-MR将具有广阔的临床应用前景。

三、电子支气管镜检查用于肺癌早期诊断

1. 高倍电子支气管镜： 高倍电子支气管镜技术(high magnifiction bronchovideoscope, HMB)是将两个检测系统融为一体，视频观测系统用于高倍率观测和纤维观测系统用于支气管镜顶端定位。视频观测系统是一种物镜光学系统，可实现高倍率观测，放大倍数约比传统电子支气管镜高四倍之多。在电视监视器上可随时观察高倍镜下的支气管黏膜，并运用纤维观察系统定位。HMB可插入气管支气管树，直至确定其病变区域，随后将支气管镜顶端靠近支气管黏膜，在监视器上观察高倍放大的支气管黏膜[25]。HMB还能够很方便的检查支气管黏膜中的微血管网，可区分支气管炎与黏膜异型增生。与支气管炎相比，支气管异型增生具有显著的血管面积比。在萤光气管镜异常萤光区域，HMB比单独使用萤光气管镜能更准确地检测出组织异型增生。

2. 高清支气管镜： 高清支气管镜检查(high-definition bronchoscopy, HDB)是一种用于观察支气管表面的改良成像技术，其画面可达到高清电视图像质量。目前已有几种高清支气管镜与图像改良的视频处理器已应用于临床。BF-H290与LUCERA ELITE视频系统中心CV-290结合使用，图像清晰，可用于对支气管表面进行详细而精确的观察。与自体荧光成像(autofluorescence imaging, AFI)电子支气管相比，配有高清支气管镜的表面强化技术的EB1990i及Pki-700对于气管内血管畸形的检测效果更佳[26]。

3. 自体萤光气管镜： 自体萤光气管镜检查(autofluorescence bronchoscopy, AFB)是一种检测正常黏膜与恶变黏膜之间的自体荧光区别技术。当用蓝光(440～480 nm)照射时，正常的支气管黏膜荧光表现为红(>630 nm)绿(520 nm)两色，病变部位的荧光呈淡棕色，而高级别异型增生或癌前病变呈红棕色。异常病灶使绿色自体荧光衰减的原因为：①支气管黏膜增生；②由于缺氧引起的核黄素增长。红色自体荧光增强是由于癌组织内过度血管化和血流丰富导致卟啉增加所致[27]。AFB能够检测到白光支气管镜无法发现的异常病灶。激光诱导荧光内镜加白光支气管镜检测上皮内肿瘤病变相对灵敏度可达到6.3，检测浸润性癌的灵敏度可达到2.71。自体荧光内镜(SAFE)1000系统使用氙灯(420～480 nm)与感光滤色片。自体荧光内镜(ASFE)3000系统能够同时使用氙灯/感光滤色片与单色二极管激光器。D-型荧光反射系统使用氙灯(380～460 nm)AFI电子支气管镜系统更是融合了3个信号：蓝光(395～445 nm)、激光自体荧光(460～690 nm)，以及两个不同波段的反射光：绿光(550 nm)与红光(610 nm)[28]。

4. 窄带成像技术： 窄带成像技术(narrow band imaging, NBI)检查与使用传统宽带蓝(400～500 nm)、绿(500～600 nm)、红(600～700 nm)三色滤波器的白光支气管镜相比，窄带成像技术使用窄带滤波器。窄带成像使用两个窄频带：蓝(390～445 nm)与绿(530～560 nm)。这两个窄频带能够穿越黏膜下层微血管结构，并实现其可视化。NBI图像增强技术可实现支气管血管结构的重点与精确观察。在几种支气管血管形态中，扭曲血管、点状血管、螺旋状血管反映了癌变过程中血管生成的发生[29]。有研究者进行Meta分析，窄带成像技术显著提高了诊断癌症前气道病变的灵敏性，特异性以及诊断优势比[30]。窄带成像技术诊断灵敏性达80%，特异性达84%。NBI+AFI提高了诊断正确率，灵敏性为68%，特异性为75%。NBI除检测癌变前气管病变外，NBI还能够区分病理类型、区分鳞状组织结构(鳞状上皮化生、鳞状上皮异型增生或鳞状细胞癌)与腺瘤。有研究表明，点状血管形态多为腺癌组织结构，而扭曲血管或突然中断血管形态多为鳞状组织结构[31]。

5. 共聚焦激光显微内镜： 共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy, CLE)系统是一种运用共焦荧光显微技术原理的新型成像技术，可以提供细胞水平在体成像[32]。CLE系统可提供对细胞与亚细胞结构的详细分析，并高度精准预测非肿瘤性病变，其灵敏度为96.0%，特异性为87.1%，准确性为91.0%[33]。将CLE的显微内镜图像与传统组织病理学图像对照，可发现不规则结缔组织结构以及代表细胞巢下层结缔组织荧光的斑点状阴影或“黑洞”(black holes)，而这或与恶性肿瘤的诊断关系密切[34]。

细胞内镜系统(endocytoscopy system, ECS)是一种无需共焦探头的综合显微内镜技术，可实现实时超高分辨率细胞样式体内诊断[35]。显微内镜(XEC-300)配备有光学放大透镜系统、电荷藕合器件以及4.2 mm的活检通道。ECS在进行支气管镜检查时可实现放大570倍，视野300×300 μm，穿透深度0～30μm，空间分辨率4.2 μm的功效。在其进行检查观察过程中，发现正常支气管黏膜中含有纤毛柱状上皮细胞，鳞状异型增生黏膜中可见胞浆丰富的表层细胞，而在鳞状细胞癌中可见细胞密度增加并呈不规则分层状的多形性癌细胞。ECS影像与光镜检查常规组织结构的结果非常吻合，ECS有助于区分正常支气管上皮细胞，异型增生细胞与恶性肿瘤细胞[36]。还有研究结果表明，ECS(XEC-120-U)在支气管内窥镜检查中被用于SCLC患者体内诊断。ECS可实现小圆形和椭圆形蓝色细胞的病灶区可视化，从而实现组织病理学对SCLC体内诊断。达到早期肺癌的诊断。

6. 气管镜腔内超声： 目前临床上可用的气管镜腔内超声(endobronchial ultrasound, EBUS)有两种： ①凸探头EBUS在气管镜顶端发出线性探测超声波，用于肺门及纵隔淋巴结以及与支气管毗邻的纵隔病变取活检；②圆径探头EBUS可为获取影像插入柔性气管镜通道的机械超声探头，临床上用于肺周边病灶成像。现已开发出几种圆径探头EBUS与导向鞘系统，并配合临床使用。最常使用的是20-MHz圆径探头EBUS(UM-S20-17S)，外径1.4 mm(1.4- mm探头)。更大的20-MHz圆径探头EBUS(UM-S20-20R)，外径1.7 mm(1.7- mm探头)也可用于被认为使用更大通道支气管镜可以到达的所有病灶。圆径探头EBUS可提供高分辨率360度的支气管周边结构以及周围性肺病灶图像[37]。最近一项Meta分析结果表明，圆径探头EBUS平均诊断率可达70.6%，优于常规气管活组织检查[38]。在不同的临床研究中，圆径探头EBUS诊断率在49.4%至92.3%之间[39]。圆径探头EBUS被频繁使用得益于与几种导航和引导手段的配合应用。超细支气管镜(ultrathin bronchoscopy)与虚拟支气管镜(virtual bronchoscopy)检查导航再加上圆径探头EBUS诊断率可在77.0%[40]，而电磁导航支气管镜(electromagnetic navigation bronchoscope)与圆径探头EBUS配合使用，对肺癌早期诊断率可高达88.0%[7]。

四、一些用于肺癌早期诊断的前沿性检测方法

1. 呼出气体冷凝液： 呼出气体冷凝液(exhaled breath condensate, EBC)的收集完全为无创，收集样本方法简便。呼出气体包含了无数挥发性化合物，如氧气、氧化一氧、二氧化氮、乙烷、戊烷以及非挥发性化合物，如气道内的小型无机离子、尿素、核酸、有机酸，氨基酸，多肽，蛋白质，表面活性剂以及大分子物质[41]。随着微陈列技术的发展、新一代测序技术，以及生物信息学检测的应用，现今已能够从非常小的样本中(如EBC)识别基因的改变[42-43]。结合GATA6与NKX2-1，基于分析基因表达与特定分子变化为基础的肺癌诊断实验，现今已达到了98.3%的高灵敏度与89.7%的高特异性[44]。对于进行创伤性或微创肺癌诊疗程度有困难的肺癌患者，EBC生物标记诊断法可能更具有特别重要的临床意义。因为EBC收集完全无创，操作简易，适用于所有患者，无需考虑患者的不良反应，而且实际上并无任何不良反应。

2. 支气管基因分类器： 新近研究发现，患肺癌的吸烟者支气管基因表达发生了变化[45]。对于这些与癌症相关的基因表达谱的检查或有助于肺癌的诊断[46]。有学者通过使用标准支气管镜的细胞刷从支气管上皮细胞中获得了RNA样本，并从中获取RNA微陈列与基因表达分类器(gene expression classifier, GEC)用于预测肺癌基本癌症基因组合的可能性。GEC对于预测存在中度肺癌的可靠性约为10%～60%，对支气管镜检查结果不确定的病例，支气管基因分类器(bronchial genomic classifier, BGC)显示具有高灵敏度(88%～89%)，而对于肺癌阴性预测值可达91.0%[47]。有研究表明，与单独使用支气管镜灵敏度的74%～76%相比，BGC+支气管镜检查提高了灵敏度，可达96%～98%[47]。GEC是对近支气管上皮细胞进行测量，而非以肺部病灶内的细胞测量。从细胞学角度分析，正常的气道内基因表达的能力，对于早期肺癌检测成为了可能。

3. 胸腔镜手术/导航手术： 尽管目前已开发出一些微创诊断程序，如支气管镜检查，但对于高度疑似肺癌的低风险患者，当患者病灶不适用其他检查诊断程序时，采用外科活检依然是被推荐的选择[48]。在诊断肺周边病灶选择手术切除的理由是避免微创诊断方法的低阴性预测值(negative predictive value, NPV)陷阱。而小于1.5 cm的肺部病灶支气管镜检总体灵敏度仅为13.5%[49]。与开胸手术比较，胸腔镜手术(video-assisted thoracic surgery)减少了肺部手术患者术后住院时间及并发症[50]。胸腔镜手术/导航手术(navigation surgery)同时能对肺部目标病灶进行诊断与治疗。胸腔镜肺部活检可对无法触诊的磨玻璃结节或不在胸膜附近的不可见病灶进行定位。现已开发了几种结节定位技术，如CT引导下的微型线圈插入术(microcoils)、金属夹(metallic clip)、定位导丝针(hook-wire)、亚甲蓝(methylene blue)、碘油(lipiodol)，以及超声波扫描(ultrasonography)等[51-55]，对于早期肺癌的诊断都具有临床意义。

五、展望

在过去的十余年间，早期肺癌的检测取得了很大的进步，无疑对早期肺癌的诊断有显著提高，而且病死率似乎也有下降趋势[2]。创新支气管镜诊断技术的发展提高了肺癌早期检测的效率。支气管镜光活检(bronchoscopic optical biopsy)可能会在未来替代传统的组织诊断活检。随着检测转向周边小型腺癌(small-sized adenocarcinomas)，导航支气管活检(image-guided fransbronchial biopsies)，如圆径探头超声支气管镜以及导航支气管镜，也已成为早期肺癌诊断的重要手段。此外，支气管基因分类器与呼出气体冷凝液技术或有助于早期肺癌的诊断与筛查。