胰腺癌人源性肿瘤组织异种移植模型的现状与展望

吴斌 王晓光 管飞红 鲍轶 钟征翔

过去几十年间，胰腺癌常用的临床前模型是体外培养的肿瘤细胞或衍生于细胞的小鼠异种移植物，该模型存在长期离体培养引起生物学性质改变从而导致基因表达模式的改变[1]、体外培养的细胞缺失肿瘤微环境[2-5]、肿瘤细胞系传代培养不能反映不同患者之间的异质性等不足。人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived tumor xenografts, PDTX)模型的出现弥补了上述不足。胰腺癌PDTX模型的建立是将新鲜的胰腺癌肿瘤组织移植到免疫缺陷鼠体内的过程，它保留了原发肿瘤的相似性，在相对真实的肿瘤基质微环境中生长、传代，高度保留了原始胰腺癌的异质性[6]，这种相似性不仅表现在基因来源、组织结构、生物学行为上，更表现为对药物的反应具有很好的平行性和预测性。

一、胰腺癌PDTX模型建立

1．胰腺癌标本的来源：(1)来源于胰腺癌手术标本，包括胰腺癌患者原发灶的新鲜手术标本和转移灶手术标本。来源于胰腺癌转移灶PDTX模型移植率高，生长时间短，更容易发生转移。Walters等[7]建立的PDTX模型中源自转移灶的移植率为88%(7/8)，而来源于原发性胰腺肿瘤的为38%(14/37，P=0.01)，且前者建模时间更短[(3.4±0.3)月比(5.1±0.5)月，P=0.02]，在第1代小鼠中肝脏和腹膜转移的发生率更高(67%比31%，P=0.002)。(2)来源于非手术活检标本，如内镜超声下穿刺活检标本(EUS-FNA)。胰腺癌患者只有少数具有手术切除机会，非手术治疗的晚期患者得益于此方法获得肿瘤组织标本，但其PDTX模型移植成功率较低，考虑可能与穿刺下难以获得足够的高质量的活组织有关[8]。(3)来源于循环肿瘤细胞。将患者血液中的循环肿瘤细胞分离出来培养并种植于免疫缺陷小鼠上，可保持患者肿瘤的异质性。此类模型也可称之为人源性肿瘤异种移植模型，但以细胞形式移植入小鼠体内，相对于肿块移植缺乏肿瘤基质作用。其优点在于为非创伤性获得标本，不绝对依赖于手术。目前前列腺癌CTC-PDTX模型已经建立，在胰腺癌中则少有报道。

2．胰腺癌PDTX移植部位：(1)皮下移植模型：皮下移植技术难度较小，手术并发症少，可通过游标卡尺直接测量肿瘤大小，动态评估药物反应对肿瘤的生长抑制率。但皮下模型很难真实模拟胰腺肿瘤微环境和肿瘤生物学行为[7]，如缺乏腹膜和肝转移。Rubio-Viqueira等[6]建立皮下胰腺癌PDTX模型，测定15个基因在移植物和原发肿瘤中的表达情况，仅3个基因表现出显著的统计学相关性，表明皮下模型可能并不能准确反映患者肿瘤基因表达。(2)肾包膜下移植模型：肾包膜下被认为是理想的移植部位，其相对于皮下模型具有丰富的血流供应，肿块生长迅速，有利于克服恶性肿瘤患者的时间窗问题[9-10]。Xue等[10]报道原发肿瘤组织移植在小鼠肾包膜下，移植成功率可达83%以上，且移植瘤保留了原始肿瘤的结构和分子特征及异质性。该移植方法目前在肺癌、前列腺癌、卵巢癌中应用较多，胰腺癌中报道较少。(3)胰腺原位移植模型：原位移植模型可表现出癌细胞和间质组织浸润进入小鼠正常胰腺组织，闭塞正常胰腺小叶[7]。该方法能最佳模拟肿瘤的微环境和生物学行为，可真实重现肿瘤的生长及转移情况。缺点在于移植技术要求高，移植成功率低，是一个更耗时、更高成本的过程，测量肿瘤大小也相当不便。某些研究组[11]利用荧光技术或者micMRI检测肿块大小，但是费用均非常高。多数研究[7,12-13]表明原位模型能极好地模拟原发肿瘤生长及转移，但也有观察到原位模型错误地预测临床活动[14]，目前仍需要大量研究加以验证。

二、胰腺癌PDTX人源性鉴定评价

目前已发表的研究主要从肿瘤形态结构、基因水平、蛋白表达及对药物的反应性等方面鉴定、评价PDTX模型。

1．肿瘤形态结构：首先可用HE染色从病理上确诊PDTX移植瘤为肿瘤组织。在形态上PDTX移植瘤结构和基质含量类似于原发性肿瘤，相比细胞系肿瘤模型能更好地重现原发肿瘤形态。然而，有研究发现PDTX移植瘤中也存在小鼠基质细胞浸润人源肿瘤细胞，表明肿瘤-基质间相互作用不能完全忽略。

2．基因水平： Rubio-Viqueira等[6]报道12例PDTX模型中第3代移植物肿瘤与患者肿瘤K-ras基因状态一致的有9例。Mattie等[15]报道了PDTX模型经历8次传代后K-ras和PIK3CA的突变频率与原发肿瘤相似，表明PDTX在基因突变上与原发肿瘤保持相似性。此外，使用单核苷酸多态性阵列技术证明这些PDTX模型间保持了个体来源异质性，证明该模型具备用于个体化治疗的前景。

3．蛋白表达水平：基因水平的一致性并不表明蛋白表达相同，可以通过蛋白质印迹法、免疫组织化学法、荧光原位杂交等手段加以验证。Rubio-Viqueira等[6]用免疫组织化学法很好地证实了12例模型中第3代移植瘤与患者肿瘤DPC4蛋白表达一致。

4．药效平行性： PDTX模型必须与患者具有相似的药物反应性。早期部分研究记录了几种抗癌药物单一疗法在异种移植模型中的反应类似于临床试验[6,16-17]。但是药物反应是一个非常复杂的过程，受许多因素影响，包括移植物、小鼠、环境等各方面因素，很有可能出现药物反应的差异，甚至出现相反的结果[18]，这就需要对模型进行药效平行性的鉴定。

三、胰腺癌PDTX模型的应用前景

1．发现新的胰腺癌药物或治疗方案：运用PDTX模型可以开发有潜力的治疗药物[6]以及方案。Villarroel等[19]用晚期胰腺癌患者术后标本建立移植动物模型，经过基因分析发现肿瘤组织对顺铂和丝裂霉素敏感、对吉西他滨耐药，用丝裂霉素C化疗，患者生存期超过36个月。Walters等[7]也发现EGFR/HER2的组合抑制剂拉帕替尼基本上不能抑制胰腺癌细胞系增殖，而在PDTX模型中，拉帕替尼和曲美比嗪治疗比吉西他滨在抑制肿瘤生长上具有更显著的作用，但是这些新药或者新的治疗组合还需要临床上有效的验证。Pérez-Torras等[12]认为胰腺癌作为一种多因素起源疾病，目前专门针对单分子靶点治疗效率低下，可能受限于肿瘤中复杂的信号调控通路，因此抑制多种信号转导途径、重新定义分子和细胞靶标等策略在治疗反应中起关键作用，胰腺癌PDTX模型为策略的指导提供了平台。

2．预测胰腺癌患者预后：PDTX模型来源于人体原发肿瘤，具有更好的代表性，所以较传统模型具有更好的预测性。研究表明[7]小鼠中建立第1代肿瘤的时间与患者生存期相关，第1代肿瘤生长至400～500 mm3所需时间，<4个月所对应的患者中位生存期仅6.3个月，而>4个月的为13.7个月，中位生存期为20.6个月患者对应的PDTX移植瘤则不能生长。由此推测在PDTX模型中较早发生转移者，其对应患者更容易发生转移，其预后也往往是不佳的。

3．预测药物疗效及耐药性：目前基于PDTX模型筛查敏感药物仅限于科学研究，还未运用于临床。预测药物疗效需要定义一个疗效的标准，大多PDX模型的治疗反应通常基于减缓的肿瘤生长动力学，而不是人类所需的肿瘤消退。然而在靶向治疗中，应该定义药物是否调节其在体内的靶标以及相关的生物学效应从而影响肿瘤生长。Li等[20]报道胰腺癌患者胸苷酸合成酶(TS)、二氢嘧啶脱氢酶(DPD)、乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)水平与 S-1治疗相关， HER2与白蛋白紫杉醇治疗反应相关，因此它们可作为相应治疗的新的生物标记物。将PDTX技术与免疫治疗技术结合，可用于肿瘤免疫治疗、靶向药物有效性和安全性的临床前评价，如免疫检查点抑制剂、CAR-T治疗、溶瘤病毒、肿瘤疫苗等。

4．标本库的建立：建立起不同胰腺癌患者来源的PDTX模型库，是可传代、活的标本库，以供不同的研究使用。

四、胰腺癌PDTX局限性

PDTX模型移植瘤与其小鼠宿主之间的关系还需要深入探索，鼠癌细胞的传代是否改变肿瘤细胞的基因型和表型也令学者担忧[6]。如果移植瘤的生成和扩增在于小鼠，该模型可能不能反映人类胰腺癌的特征以及作为个体化治疗工具的作用可能有限。但目前大部分研究认为在移植肿瘤中肿瘤细胞起主要的决定和维持作用[21-22]。移植于小鼠的人源性肿瘤可能会受小鼠体内微环境的影响，但这种影响的大小还需要实验加以验证。从已有的研究来看，传代后的肿瘤组织与原代相似度达90%以上，表明这种影响存在，但作用不明显。

PDTX虽然在临床前试验得到验证，但目前PDTX模型构建需要的肿瘤标本主要局限于具有早期肿瘤的患者手术切除。对胰腺癌这类不易早期发现的恶性肿瘤，解决这个问题还需要提高胰腺癌的早期检出率，使得更多的患者具有手术机会，从而得益于PDTX带来的个体化治疗。此外，PDTX模型仅能模拟可切除患者原发肿瘤的生物学行为及药物反应，转移性胰腺癌患者是否显示不同的模式，还需要更多的实验研究进行评估。建立PDTX模型需要较长时间，肿瘤移植潜伏期(从植入到异种移植肿瘤生长成型)可能从2个月到12个月。移植率通常取决于肿瘤类型、肿瘤侵袭性等因素， Li等[20]研究将3个月仍未达移植瘤目标大小的模型退出实验，强调了模型建立的时效性。事实上，高移植率的患者通常具有高转移风险以及较差的预后。若要将模型运用于指导用药及预测预后，缩短模型建立周期也是将来需要面对的一个问题。

五、展望

精准、个性化是未来医学的发展方向，精准医学是根据患者独特的遗传和分子特征来指导治疗，也称为个体化医学。目前临床试验疗效取决于大样本、多中心患者群体，其多无法提供个性化治疗依据，精准医学要求在患者存活期间利用能代表患者的模型探索最佳疗法，而来源于患者的PDTX模型满足了这一要求。美国国家癌症研究所临床试验规划会议建议开发新的临床前肿瘤模型从而更好地预测人胰腺癌的预后，它指出PDTX模型可作为药物筛选、生物标记物发展、扩展有关胰腺癌生物学知识强大的平台[13]。但是胰腺癌PDTX研究处于起步阶段，充满挑战。目前PDTX模型所用的小鼠为裸鼠或者NOD-SCID小鼠，裸鼠缺乏T细胞免疫,但是B细胞及NK细胞免疫依然存在，NOD-SCID小鼠缺乏T细胞、B细胞、NK细胞免疫，两者均不能最好地模拟原发肿瘤所在人体内的免疫反应。此前研究人员曾运用基因工程小鼠建立胰腺的原位模型，优势在于存在完整的免疫系统，但与其他基因工程小鼠模型一样，局限于预定的特异性遗传突变，很难反映人类胰腺癌的遗传多样性。期待个体免疫来源的移植瘤模型即肿瘤免疫双人源化小鼠模型早日出现，使其真正发挥个体化“替身”作用，为胰腺癌患者寻找最有效的药物以及个体化治疗方案提供更好的依据。