钩藤碱固体脂质纳米粒的毒性研究

2018-01-12田宝成田桂芹商林林张长远赵亚鑫

西北药学杂志 2018年1期

王盟,田宝成,田桂芹,商林林,张长远 ,赵亚鑫

(1.济宁市第一人民医院医务部,济宁 272000；2.滨州医学院药学院,烟台 264000；3.济宁市传染病医院药剂科,济宁 272000；4.济宁市第二人民医院药剂科,济宁 272000)

钩藤为茜草科植物钩藤的带钩茎枝,具有镇静、降压、清热平肝、息风定惊的功能,是治疗心脑血管疾病的首选药材之一,临床上有着悠久的应用历史。[1-2]。钩藤碱(Rhy)为钩藤的有效成分之一,能够抑制外周血管收缩,使血管阻力降低,血压降低,同时有抗血小板聚集和抗血栓的作用[3-4]。笔者利用现代纳米技术将钩藤碱制成固体脂质纳米粒(Rhy-SLN),为进一步确定其毒性及毒性靶器官,本实验在前期研究的基础上,进行了钩藤碱固体脂质纳米粒对大鼠的长期毒性实验研究,并与钩藤碱缓释滴丸[5](Rhy-SDP)的毒性进行了比较。

1 仪器与材料

1.1仪器 JA2003N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；DDL-6型低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器有限公司)；BC-3000血液分析仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)；TBA-40 FR型全自动生化分析仪(日本东芝有限公司)。

1.2试药 Rhy-SLN(批号20161012)，Rhy-SDP(批号20150423)，均为实验室自制。

1.3动物 SPF级Wistar大鼠,体质量为140～170 g,雌雄各半,由济宁医学院动物中心提供,动物合格证号：20030011。动物饲养条件：动物室为普通级,室温：25 ℃,相对温度：40%,通风、光照良好,采用标准饲料喂养。雌雄分笼饲养,每笼5只,自由饮水[6]。

2 方法

2.1Rhy-SLN的制备精密称取处方量的钩藤碱、脂质、卵磷脂(8 mg∶80 mg∶100 mg)溶于适量的无水乙醇中,于75 ℃水浴下形成有机相。另取处方量的F-68溶于相同温度的水中,保温,构成水相。将油相缓慢滴加到高速旋转(转速1 000 r·min-1)的水相中。搅拌2 h,浓缩体积至原来的1/2。将所得的半透明体系快速分散于冰水中,继续搅拌2 h,过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.2急性毒性实验将小鼠禁食16 h后,按体质量随机分为11组,每组10只,雌雄各半,1～5组灌胃不同剂量的Rhy-SDP(1 420,1 825,2 245,2 965和3 347 mg·kg-1)混悬液,6～10组灌胃不同剂量(1 280,1 600,2 000,2 500和3 125 mg·kg-1)的Rhy-SLN混悬液,空白组给予小鼠体积分数为0.5%的CMC-Na,灌胃量均为0.02 mL·g-1。即刻观察各组出现的毒性反应,连续观察14 d,记录动物的毒性反应及死亡情况[7-8 ]。

2.3长期毒性实验将大鼠禁食16 h后,按照体质量随机分为为空白对照组(蒸馏水)、Rhy-SLN高剂量组(80 mg·kg-1)、Rhy-SLN低剂量组(16 mg·kg-1)、Rhy-SDP高剂量组(80 mg·kg-1)和Rhy-SDP低剂量组(16 mg·kg-1),每组20只,雌雄各半[9-11]。各组按照每日10 mg·kg-1灌胃给药1次,连续给药12周,每日观察大鼠的一般状况、隔1周记录1次大鼠体质量的变化。末次给药后24 h,各组随机挑选大鼠10只进行血液学相关指标的检测。取血后,处死大鼠,取其心、脑、肾、肝等器官,计算脏体比值(mg·g-1),并用体积分数为10%的甲醛溶液固定大鼠器官,常规石蜡包埋,制作切片,HE染色,光镜下观察器官的组织病理学变化。剩余10只动物停药,继续饲养观察2周后,同上述方法进行检测[12-14 ]。

3 结果

3.1Rhy-SDP的形态观察与粒径分布滴加经稀释的Rhy-SLN混悬液1 滴于覆盖碳膜的铜网上,以质量浓度为0.1 g·L-1的磷钨酸负染,室温干燥,透射电子显微镜下观察药物纳米结晶形貌。Rhy-SLN呈圆形,分布均匀。见图1。

室温条件下,将所制得的Rhy-SLN混悬液,以纯化水稀释 20 倍,NanoZS90 激光粒度仪上测定纳米粒的粒径、粒径分布,结果显示平均粒径在180 nm左右。见图2。

图1Rhy-SLN透射电镜图

Fig.1 The scanning electron microscopy of Rhy-SLN

图2Rhy-SLN粒径分布

Fig.2 The distribution of size of Rhy-SLN

3.2急性毒性实验给药后,空白对照组小鼠未见异常反应,Rhy-SLN剂量组和Rhy-SDP剂量组的小鼠毒性反应基本相似,Rhy-SLN剂量组小鼠毒性反应轻于Rhy-SDP剂量组。部分小鼠出现活动减少、呼吸急促、摄食量减少,部分小鼠出现死亡情况,死亡小鼠尸检主要脏器心、脑、肾、肝未见明显异常,存活动物24 h后恢复正常。用BLISS统计法计算得Rhy-SLN的LD50为2 125.5 mg·kg-1,95%CI为2 019.2～2 231.6 mg·kg-1；Rhy-SDP的LD50为1 900.7 mg·kg-1,95%CI为1 651.8～2 167.9 mg·kg-1。

3.3长期毒性实验

3.3.1大鼠一般状况观察给药期间,空白对照组、Rhy-SLN高剂量组、Rhy-SLN低剂量组和Rhy-SDP低剂量组大鼠的一般状态、行为活动及粪便等未见明显的异常变化,停药恢复2周后,亦无明显变化。Rhy-SDP高剂量组大鼠出现毛色暗淡无光、行为缓慢、体质量增长缓慢；停药恢复2周后大鼠状态基本恢复正常,体质量增长恢复正常。Rhy-SLN和Rhy-SDP不同剂量组对大鼠的体质量影响不同,但与空白对照组比较差异均无统计学意义。见图3。

3.3.2对大鼠血液学指标的影响末次给药后及恢复期的空白对照组、Rhy-SLN及Rhy-SDP各给药组大鼠的WBC、RBC、HB、PLT、LYM和NEU的数值均在正常范围内,无明显的变化。见表1～2。

表1Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠血液学指标的影响

Tab.1 The effects of Rhy-SLN and Rhy-SDP on hematology index in rats (n=10,±s)

表2恢复期Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠血液学指标的影响

Tab.2 The effects of Rhy-SLN and Rhy-SDP on hematology indexes in rats of recovery phase (n=10,±s)

图3大鼠体质量变化曲线

Fig.3 Curve of the rat body quality variation

3.3.3对大鼠血液生化学指标的影响各给药组大鼠给予Rhy-SLN和Rhy-SDP 12周后,大鼠血清中ALT、AST和ALP的数值升高,且有一定的剂量依赖性。Rhy-SDP高剂量组大鼠血清ALT、AST和ALP活性与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),Rhy-SLN高剂量组大鼠血清ALT活性与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

大鼠停止用药恢复2周后,各给药组大鼠的血液生化指标均已明显恢复,Rhy-SDP高剂量组ALT活性与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3.3.4脏体比值各给药组大鼠给予Rhy-SLN和Rhy-SDP 12周后,其中Rhy-SLN低、高剂量组和Rhy-SDP低剂量组大鼠的心、脑、肾的脏体比与空白对照组比较均无明显变化；Rhy-SDP高剂量组大鼠肝的脏体比与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表3Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠血液生化学指标的影响

Tab.3 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on blood biochemical indexes in rats (n=10,±s)

注：与空白对照组比较*P<0.05。

表4恢复期Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠血液生化学指标的影响

Tab.4 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on blood biochemical index in rats recovery phase (n=10,±s)

注：与空白对照组比较*P<0.05。

见表6。由表6可知,大鼠停止用药恢复2周后,Rhy-SLN和Rhy-SDP的低、高剂量组大鼠的心、脑、肾、肝的脏体比与空白对照组比较均无显著变化。

表5Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠脏体比值的影响

Tab.5 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on the ratio of organs to body in rats (n=10,±s,mg·g-1)

注：与空白对照组比较*P<0.05。

表6恢复期Rhy-SLN和Rhy-SDP对大鼠脏体比值的影响

Tab.6 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on the ratio of organs to body in rats of recovery phase (n=10,±s,mg·g-1)

3.3.5病理组织学观察

3.3.5.1心、脑、肾各组大鼠心脏、脑组织和肾脏结构均正常,未见明显异常。

3.3.5.2肝空白对照组肝脏组织结构完整,未见肝细胞肿胀坏死,肝小叶轮廓清晰,间质未见明显炎症细胞浸润,见图4A。Rhy-SLN低、高剂量组和Rhy-SDP低剂量组大鼠肝组织未见明显异常,见图4B。Rhy-SDP高剂量组大鼠肝组织部分失去正常结构,大部分肝细胞肿胀,胞质空网状,似气球样变,部分肝细胞出现坏死,见图4C。停药恢复期大鼠Rhy-SLN低、高剂量组和Rhy-SDP低剂量组肝组织均未出现异常,Rhy-SDP高剂量组大鼠肝细胞肿胀减轻,气球样变消失,仍有个别点状坏死灶,见图4D。

图4大鼠肝脏病理切片图

A.空白对照组；B.Rhy-SLN低、高剂量组和Rhy-SDP低剂量组；C.Rhy-SDP高剂量组；D.Rhy-SDP高剂量组恢复期。

Fig.4 The pathological image of rat liver

A.Blank control group；B.low and high-dose groups of Rhy-SLN and low-dose group of Rhy-SDP；C.high-dose groups of Rhy-SDP；D.high-dose groups of Rhy-SDP recovery phase.

4 讨论

钩藤总生物碱为钩藤的主要有效活性成分,其中主要的是钩藤碱和异钩藤碱,分别占钩藤总生物碱的28.9%和14.7%[15-17]。研究发现,钩藤碱具有抗血栓形成、抗血小板聚集等作用[18-20]。笔者在前期将钩藤碱制成缓释滴丸并进行了相关药理和毒性研究,为了进一步改善钩藤碱的剂型、增加生物利用度、减少毒性反应,笔者利用现代纳米技术将钩藤碱制成固体脂质纳米粒,并进行了急性毒性和长期毒性的实验研究。

实验发现,Rhy-SLN的LD50值(2 125.5 mg·kg-1)高于Rhy-SDP(1 900.7 mg·kg-1)的LD50值,说明Rhy-SLN对小鼠的急性毒性低于Rhy-SDP。死亡动物的重要器官未见明显异常。

在长期实验中,给予大鼠灌胃给药12周后,Rhy-SDP高剂量组大鼠出现毛色暗淡无光、行为缓慢、体质量增长缓慢等现象；血液学指标基本正常,血液生化指标中AST、ALT和ALP的活性均有不同程度的升高；大鼠心、脑、肾脏的脏体比值无明显变化,肝脏的脏体比值明显升高；病理学结果显示,肝组织部分失去正常结构,大部分肝细胞肿胀,胞质空网状,似气球样变,部分肝细胞出现坏死。恢复2周后Rhy-SLN低、高剂量组和Rhy-SDP低剂量组肝组织均未出现异常,Rhy-SDP高剂量组大鼠肝细胞肿胀减轻,气球样变消失,仍有个别点状坏死灶。

研究结果显示,Rhy毒性靶器官为肝脏,Rhy-SLN长期大剂量大鼠灌胃给药,可产生一定的肝脏毒性；Rhy-SLN长期大剂量大鼠灌胃给药,肝脏毒性不明显。结果表明,固体脂质纳米粒剂型可显著降低Rhy对肝脏的损害,降低大鼠血液AST和ALT水平,其具体机制有待进一步研究。

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