用山银花与金银花制备双黄连口服液质量比较研究

李 纳,李姣娇,范 蕾,陈章宝*

(1.西南大学药学院,重庆 400716；2.四川省南充卫生学校,南充 637000)

金银花和山银花均为常用药材,应用广泛[1-4]。《中国药典》2010年版将金银花与山银花区分开,并将灰毡毛忍冬的花蕾作为山银花的来源之一[5]。灰毡毛忍冬基部无明显苞片,主要为非腺毛,而忍冬花含有大型的叶状苞片,花外表皮具有较多腺毛[6-8]。山银花具有清热解毒、疏散风热的功效,临床上常用于治疗热毒血病和风热感冒等疾病。山银花能显著抑制发热模型大鼠的发热现象,与金银花二者之间的解热强度相差无几[9-11]。双黄连口服液是由黄芩、金银花和连翘 3 味中药精制而成的合剂,具有疏风解表、清热解毒的功效,对外感风热引起的感冒具有良好的疗效[12-13]。《中国药典》2015年版将该药品中的绿原酸、连翘苷和黄芩苷含量作为产品的指标成分[14]。

自《中国药典》颁布以来,有关金银花基源的规定几经更迭,但在实际应用中,仍存在金银花与山银花药材混用的现象。本研究将山银花用于制备双黄连口服液,比较山银花和金银花制备双黄连口服液的质量差异,探究山银花用于制备双黄连口服液的可行性,为山银花用于双黄连口服液的制备提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 UV3100紫外分光光度计(天美科技有限公司)；LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

1.2试药 连翘(批号160330)、黄芩(批号160501),购自重庆康迪药业有限公司；“三精”双黄连口服液(哈药集团三精制药有限公司,批号 Z10920053,原材料为金银花)；绿原酸(质量分数>98%,批号R05F6F1),黄芩苷(质量分数>98%,批号P09M7F10367),连翘苷(质量分数>98%,批号P20J7F9279),均购自上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

山银花(购自重庆市秀山县,经西南大学药学院齐红艺教授鉴定为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬LoniceraeFlos的干燥花蕾)；金银花(重庆康迪药业有限公司,产地：山东,批号160701,经西南大学药学院齐红艺教授鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬LoniceraeJaponicaeFlos的干燥花蕾)。

2 方法与结果

2.1双黄连口服液的制备

2.1.1金银花制备的双黄连口服液 按照《中国药典》2015年版中的方法进行制备[14]。

黄芩提取物的制备：称取黄芩 375 g,加水煎煮3次,每次1 h,合并煎液,滤过,滤液浓缩并加入2 mol·L-1的盐酸溶液调节pH值至1.0～2.0,保温1 h后静置过夜,滤过,沉淀加7倍量水,用质量浓度为400 g·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,再加等量无水乙醇,搅拌使溶解,滤过,滤液用盐酸溶液调节pH值至2.0,60 ℃保温30 min,静置过夜,滤过,沉淀用无水乙醇洗至pH值为7.0,挥尽乙醇备用。

金银花提取物的制备：称取金银花375 g、连翘750 g,温水浸泡30 min,煎煮2次,每次1.5 h,合并煎液,滤过,将滤液浓缩至相对密度为1.25,放冷至40 ℃时缓缓加入无水乙醇,使乙醇体积分数达75%,充分搅拌,静置过夜,滤取上清液,残渣再加体积分数为75%的乙醇提取,合并乙醇液,回收乙醇至无醇味。

将上述2种提取物合并,加水适量,用质量浓度为400 g·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,搅匀,4 ℃冷藏3 d,滤过,滤液加入蔗糖300 g,搅拌使溶解,再加入香精适量,调节pH值至7.0,加水定容至1 000 mL,搅匀,静置1 d,滤过,灌装,灭菌,即得。

2.1.2山银花制备双黄连口服液 按照《中国药典》2015年版方法进行制备[14]。

处方：山银花375 g,黄芩375 g,连翘750 g。制法：按照2.1.1项下金银花制备双黄连口服液的方法进行制备。

2.2双黄连口服液的含量测定

2.2.1绿原酸

2.2.1.1绿原酸标准曲线的制备 参考相关文献[15-18],以质量浓度为100 μg·mL-1的绿原酸作为储备液,分别取一定量用流动相稀释至质量浓度为0.5,1,2,3,4,5,6和7 μg·mL-1。色谱柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-2 mL·L-1磷酸(20∶80)；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；检测波长：327 nm；以绿原酸质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y),计算得回归方程：y=63 867x-1 232.1,r=0.999 6。结果表明，在0.5～7.0μg·mL-1的范围内,绿原酸的峰面积与质量浓度呈线性关系。

2.2.1.2绿原酸的含量测定 参考《中国药典》2015年版规定[14],精密量取双黄连口服液2 mL,置于50 mL棕色量瓶中,加水定容至刻度,摇匀,待测。分别精密吸取供试品溶液20 μL,液相色谱仪自动进样,测定。本品每l mL金银花含量以绿原酸计,平行操作3次,不得少于0.60 mg。

结果表明,山银花制备得到的双黄连口服液中绿原酸质量浓度最高,为2.052 4 mg·mL-1；金银花双黄连口服液和“三精”双黄连口服液中绿原酸的质量浓度分别为0.916 8和0.767 9 mg·mL-1,均符合《中国药典》规定。

2.2.2连翘苷 参考《中国药典》2015年版规定[14],色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈-水(25∶75)为流动相,检测波长为278 nm。理论塔板数按照连翘苷峰计算应不低于6 000。取连翘苷对照品适量,用体积分数为50%的甲醇制成质量浓度为60 μg·mL-1的溶液,即得对照品溶液。取各双黄连口服液1 mL,加入中性氧化铝柱(100～120目,6 g,内径为1 cm),用40 mL体积分数为70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩至干,加体积分数为50%的甲醇适量,温热溶解,移至5 mL量瓶中,定容至刻度,即得供试品溶液。液相色谱仪自动进样各10 μL,测定。本品每1 mL连翘含量以连翘苷计,平行操作3次,不得少于0.30 mg。

实验表明,山银花双黄连口服液的连翘苷含量最高,质量浓度为2.940 5 mg·mL-1；金银花双黄连口服液连翘苷的质量浓度为2.336 1 mg·mL-1；“三精”双黄连口服液的连翘苷含量最少,质量浓度为0.529 1 mg·mL-1。均符合《中国药典》规定。

2.2.3黄芩苷 参考《中国药典》2015年版规定[14],色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-10 mL·L-1冰醋酸(50∶50∶1)为流动相；检测波长为274 nm；理论塔板数按照黄芩苷峰计算应不低1 500。取黄芩苷对照品适量,用体积分数为50%的甲醇制成质量浓度为0.1 mg·mL-1的溶液,即得对照品溶液。取各双黄连口服液1 mL,置于50 mL量瓶中,加体积分数为50%的甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。液相色谱仪自动进样5 μL,测定。本品每1 mL黄芩含量以黄芩苷计,不得少于10 mg。

实验表明,“三精”双黄连口服液中黄芩苷含量最高,为17.022 6 mg·mL-1；山银花、金银花双黄连口服液的黄芩苷质量浓度分别为12.448 4和16.640 5 mg·mL-1,均大于10 mg·mL-1。3种双黄连口服液均符合《中国药典》规定。

2.3山银花、金银花制备的双黄连口服液与“三精”双黄连口服液比较

2.3.1紫外全波长扫描 取山银花、金银花双黄连口服液以及“三精”双黄连口服液,稀释到一定质量浓度,用紫外分光光度计进行全波长(190～600 nm)扫描。

结果表明,绿原酸在327 nm波长处有最大吸收,黄芩苷、连翘苷分别在274和278 nm波长处有最大吸收,山银花、金银花双黄连口服液与“三精”双黄连口服液的紫外吸收差别不大。

2.3.2高效液相指纹图谱对比

2.3.2.1黄芩苷 参考《中国药典》2015年版规定[14]。色谱柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水-冰醋酸(50∶50∶1)；流速：1.0 mg·min-1；进样量：5 μL；检测波长：274 nm。

山银花、金银花双黄连口服液以及“三精”双黄连口服液黄芩苷均在10.323 min出峰,指纹图谱显示,3种双黄连口服液均在274 nm波长处检测黄芩苷,差异较小。结果见图1。

图1黄芩苷HPLC指纹图谱

S1.金银花双黄连口服液；S2.山银花双黄连口服液；S3：“三精”双黄连口服液；S4.黄芩苷对照品。

Fig.1 HPLC fingerprint of baicalin

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.baicalin standard.

2.3.2.2连翘苷 参考《中国药典》2015年版规定[14]。色谱柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(25∶75)；流速：1.0 mg·min-1；进样量：10 μL；检测波长：278 nm。

山银花、金银花双黄连口服液以及“三精”双黄连口服液连翘苷均在12.605 min出峰,指纹图谱显示,3种双黄连口服液均在278 nm波长处检测连翘苷,差异较小。结果见图2。

2.3.2.3绿原酸 参考《中国药典》2015年版规定[14]。色谱柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-2 mL· L-1磷酸(20∶80)；流速：1.0 mg·min-1；进样量：20 μL；检测波长：327 nm。

图2连翘苷HPLC指纹图谱

S1.金银花双黄连口服液；S2.山银花双黄连口服液；S3.“三精”双黄连口服液；S4.连翘苷对照品。

Fig.2 HPLC fingerprint of forsythin

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid ofLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid ofLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.forsythin standard.

山银花、金银花双黄连口服液以及“三精”双黄连口服液绿原酸均在4.174 min出峰,指纹图谱显示,3种双黄连口服液均在327 nm波长处检测绿原酸,差异较小。结果见图3。

图3绿原酸HPLC指纹图谱

S1.金银花双黄连口服液；S2.山银花双黄连口服液；S3.“三精”双黄连口服液；S4.绿原酸对照品。

Fig.3 HPLC fingerprint of chlorogenic acid

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.chlorogenic acid standard.

2.3.3TLC鉴别

2.3.3.1绿原酸、黄芩苷 参考《中国药典》2015年版规定[14],取本品1 mL,加体积分数为75%的乙醇5 mL,作为供试品溶液。另取黄芩苷、绿原酸对照品,用体积分数为75%的乙醇制成质量浓度为0.1 mg·mL-1的对照品溶液。按照TLC法进行实验,用毛细管吸取上述各溶液适量,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以醋酸为展开剂展开,取出,晾干,置于365 nm紫外光灯下检视。

山银花、金银花以及“三精”双黄连口服液,在与黄芩苷对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点；在与绿原酸对照品色谱相应的位置上,显相同颜色荧光斑点,且三者差异较小。实验结果见图4A。

2.3.3.2连翘苷 按照连翘苷TLC鉴别方法[14,19]：取本品1 mL,加甲醇5 mL使溶解,静置,取上清液,作为供试品溶液。另取连翘对照药材0.5 g,加甲醇10 mL,加热回流20 min,滤过,滤液作为对照药材溶液。按照TLC法(通则0502)实验,吸取上述2种溶液适量,分别点于同一硅胶G薄板上,以三氯甲烷-甲醇(5∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。

山银花、金银花以及“三精”双黄连口服液,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色斑点,且三者差异较小。实验结果见图4B。

图4TLC图

A:1.黄芩苷对照品；2.绿原酸对照品；3.山银花双黄连口服液；4.金银花双黄连口服液；5.“三精”双黄连口服液。B:1.连翘苷对照品；2.连翘苷对照药材；3.山银花双黄连口服液；4.金银花双黄连口服液；5.“三精”双黄连口服液。

Fig.4 TLC chromatograms

A:1.baicalin standard；2.chlorogenic acid standard；3.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；4.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；5."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid.B:1.forsythin standard；2.chlorogenic acid standard；3.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；4.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；5."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid.

3 讨论

本研究按照《中国药典》方法分别制备山银花和金银花双黄连口服液,采用HPLC法,测得山银花、金银花以及“三精”双黄连口服液绿原酸的质量浓度分别为2.052 4,0.916 8和0.767 9 mg·mL-1,均符合《中国药典》规定,且山银花双黄连口服液中的绿原酸含量远高于金银花以及“三精”双黄连口服液；研究表明,山银花、金银花以及“三精”双黄连口服液中连翘苷质量浓度分别为2.940 5，2.336 1和0.529 1 mg·mL-1,均符合《中国药典》2015年版规定；“三精”双黄连口服液黄芩苷质量浓度为17.022 6 mg·mL-1,山银花、金银花制备双黄连口服液黄芩苷质量浓度略低,分别为12.448 4和16.640 5 mg·mL-1,均符合《中国药典》2015年版规定。比较“三精”双黄连口服液连翘苷、黄芩苷和绿原酸指纹图谱及其含量差异,三者指纹图谱差异较小。利用紫外分光光度计和TLC法对3种不同双黄连口服液进行比较,研究结果显示,三者制备的双黄连口服液质量差异较小,按照《中国药典》现行质量检测规定山银花可用于制备双黄连口服液。

[1] 银胜高,辛宁.山银花的研究概况[J].时珍国医国药,2007,18(12):2920-2922.

[2] 何晶.金银花的药理作用及临床应用[J].天津药学,2008,20(5):74-76.

[3] 范文昌,葛虹,廖彩云.金银花的综合利用[J].广州化工,2012,40(24):16-18.

[4] 庄丽,张超,阿里穆斯.金银花的药理作用与临床应用研究进展[J].辽宁中医杂志,2013,40(2):378-380.

[5] 国家药典委员会.中国药典：2010年版：一部[S].北京：中国医药科技出版社,2010:28.

[6] 杨翠玲.易混品金银花与山银花的鉴别[J].山西中医学院学报,2006,7(4):48.

[7] 吴飞燕,冯宋岗,曾建国.金银花和山银花的鉴别与归属研究[J].中草药,2014,45(8):1150-1156.

[8] 耿世磊,赵晟,姚飞平,等.金银花与山银花原植物叶表皮特征的比较研究[J].中草药,2006,37(12):1869-1872.

[9] 雷志钧,周日宝,曾嵘,等.灰毡毛忍冬与正品金银花解热作用的比较研究[J].湖南中医药大学学报,2005,25(5):14-15.

[10]石钺,石任兵,陆蕴如.我国药用金银花资源、化学成分及药理研究进展[J].中国药学杂志,1999,34(11):724-727.

[11]雷志钧,周日宝,童巧珍,等.灰毡毛忍冬与正品金银花安全性比较[J].中成药,2006,28(5)：759-761.

[12]周雪梦,陆春妮,亓文宝,等.清开灵和双黄连口服液体内抗禽流感病毒作用[J].中草药,2011,42(7):1351-1356.

[13]杜英峰,张兰桐,靳怡然,等.多波长RP-HPLC法测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸和连翘苷[J].中成药,2009,31(9):1368-1371.

[14]国家药典委员会.中国药典：2015年版：一部[S].北京：中国医药科技出版社,2015:28.

[15]王艳艳,徐晓玉,邓君,等.HPLC法同时测定灰毡毛忍冬中绿原酸与木犀草苷的含量[J].中药材,2009,32(11):1705-1707.

[16]刘敏彦,高淑丽,刘丽华,等.HPLC法同时测定不同产地金银花和山银花中6种有机酸成分[J].中药材,2013,36(2):196-198.

[17]徐玲,张继芬,吴芳洲,等.HPLC法测定双花颗粒中绿原酸的含量[J].中国药房,2011,22(23)：2156-2157.

[18]笔雪艳,张清波,刘晓凤,等.7种常用中药制剂中金银花与山银花的应用初探[J].药物分析杂志,2010,30(11):2208-2211.

[19]刘静.肺炎糖浆的质量标准研究[J].西北药学杂志,2016,31(4):364-367.