藏骨宝胶囊的质量标准研究

周 虹,高素莉,杨志福,文爱东

(第四军医大学第一附属医院药剂科,西安 710032)

中药复方制剂藏骨宝胶囊[兰制字(2011)F68012]为本院自制制剂,全方主要由打箭菊、甘青青兰、秦皮和藏木香等组成,是藏药秘方,具有接骨蓄筋、强身健体的功效,临床用于治疗骨折后的疼痛和抗骨质疏松[1]。秦皮作为君药,其活性成分为秦皮甲素和秦皮乙素,具有抗炎、镇痛[2]的功效；土木香内酯是藏木香[3-5]的主要成分,具有行气止痛的功效；齐墩果酸是甘青青兰的主要成分,具有清热祛湿、疏风解表的功效[6]。现行的质量标准对TLC鉴别描述不规范,无含量测定的质量控制。为了更好地控制药品质量,在原标准基础上完善了藏木香和甘青青兰的TLC鉴别,建立了秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定,方法简单准确,提高了标准对药品质量的可控性。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪,包括输液泵(LC-10Atvp)和紫外检测器(SPD-10Avp)(日本岛津公司)；SQP分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 藏骨宝胶囊(第四军医大学西京医院药剂科提供,批号：130810,130811,130812)；土木香内酯对照品(批号110760-200507)、齐墩果酸对照品(批号110709-200505)、秦皮甲素对照品(批号 110740-200405,质量分数98.5%)和秦皮乙素对照品(批号110741-200506,质量分数97.1%),均购自中国食品药品检定研究院；阴性样品为自制；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；乙腈为色谱醇；其余试剂为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1土木香内酯的TLC鉴别 取本品内容物2 g,加氯仿20 mL,超声处理30 min[7-8],滤过,将滤液浓缩至5 mL,作为供试品溶液。取按照样品同样工艺制备而成的缺藏木香的阴性样品2 g,按照上述方法制备缺藏木香的阴性对照溶液。另取土木香内酯对照品,加氯仿制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液；按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验,吸取上述3种溶液各6 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(5∶2)为展开剂[9],展开,取出,晾干,喷以0.5 g·L-1的香草醛硫酸溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见图1A。

2.2齐墩果酸的TLC鉴别 取本品内容物2 g,加甲醇35 mL,超声30 min[10],滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇溶液2 mL,作为供试品溶液。取按照样品同样工艺制备而成的缺甘青青兰的阴性样品2 g,按照上述方法制备缺甘青青兰的阴性对照溶液。另取齐墩果酸对照品,加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验,吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5)为展开剂[11-12],展开,取出,晾干,喷以100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见图1B。

2.3秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定

2.3.1色谱条件 色谱柱：Kromasi1 C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)[13]；检测波长：334 nm[14]；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

A B

图1TLC图

A.土木香内酯：1,4.土木香内酯对照品；2.藏骨宝胶囊样品；3.缺藏木香阴性对照。B.齐墩果酸：1,4.齐墩果酸对照品；2.藏骨宝胶囊样品；3.缺甘青青兰阴性对照。

Fig.1 TLC chromatograms

A.alantolactone：1,4.reference of alantolactone；2.Zanggubao Capsules sample；3.negative control lack of Tibet inula.B.oleanic acid:1,4.reference of oleanic acid；2.Zanggubao Capsules sample；3.negative control lack ofHerbaDracocephaliTangutici.

2.3.2溶液的制备

2.3.2.1对照品溶液 分别精密称取秦皮甲素和秦皮乙素对照品5和2 mg,分别置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得系列对照品储备液。分别精密吸取秦皮甲素和秦皮乙素储备液4.0和3.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,即得系列对照品溶液。

2.3.2.2供试品溶液 称取本品0.5 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇45 mL,超声处理30 min,放冷,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45 μm滤膜,作为供试品溶液。

2.3.2.3阴性样品溶液 按照处方比例和制备工艺制成不含秦皮甲素和秦皮乙素的样品,按照2.3.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3.3方法学考察 取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μL,依次进样进行图谱分析。结果显示,在与对照品色谱峰相应的位置上,供试品有相同保留时间的色谱峰,阴性样品溶液则在此位置无吸收、无干扰。见图2。

2.3.4线性关系 精密称取秦皮甲素、秦皮乙素对照品2.71和1.64 mg,分别置于25 mL量瓶中,以甲醇为溶剂,配制成质量浓度分别为108.4和65.6 μg·mL-1的秦皮甲素和秦皮乙素对照品溶液,分别吸取2种对照品溶液各0.5,1,2,3,4,5 mL,置于10 mL量瓶中,分别加甲醇定容至刻度。依次注入高效液相色谱仪,测定峰面积,记录色谱图。以对照品的质量浓度C为横坐标(x)、对照品的峰面积A为纵坐标(y),绘制标准曲线。秦皮甲素的回归方程为：y=16 302x-7 249.3,r=0.999 3,结果表明,秦皮甲素质量浓度在5.42～54.2 μg·mL-1范围内线性关系良好。秦皮乙素的回归方程为：y=36 579x-9 377.2,r=0.999 5,结果表明,秦皮乙素质量浓度在3.28～32.8 μg·mL-1范围内线性关系良好。

图2HPLC图

1.秦皮甲素对照品；B.秦皮乙素对照品；C.供试品；D.阴性对照；1.秦皮甲素；2.秦皮乙素。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.aesculin reference substance；B.esculi reference substance；C.sample；D.negative；1.aesculin； 2.esculi.

2.3.5精密度 精密吸取2.3.2.1项下制备的秦皮甲素(54.2 μg·mL-1)和秦皮乙素(32.8 μg·mL-1)对照品溶液各20 μL,按照2.3.1项下色谱条件进样,重复测定6次峰面积(A),考察其精密度。结果表明,秦皮甲素峰面积(A)和秦皮乙素峰面积(A)的RSD值分别为0.68%(n=6)和0.96% (n=6),结果表明,该方法精密度良好。

2.3.6稳定性 精密吸取同一份供试品溶液(批号130810),分别在0,2,4,6,8和12 h进行测定,秦皮甲素和秦皮乙素峰面积的RSD值分别为0.84% (n=6)和1.82% (n=6),结果表明,样品溶液在配制后的12 h内稳定。

2.3.7重复性 精密称取同一批样品6份(批号130810),按照2.3.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.3.1项下色谱条件进行测定。秦皮甲素和秦皮乙素峰面积的RSD值分别为1.43% (n=6)和0.55% (n=6),结果表明,该方法重复性良好。

2.3.8加样回收率 精密称取已知含量的样品9份(批号130811,含秦皮甲素8.330 0 mg·g-1,含秦皮乙素2.380 0 mg·g-1),各0.25 g,精密称定,加入秦皮甲素和秦皮乙素对照品适量,按照2.3.2.2项下方法制备供试品溶液,依次进样测定,计算回收率,结果见表1～2。

表1秦皮甲素的回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test of aesculin (n=9)

表2秦皮乙素的回收率实验结果

Tab.2 Results of recovery test of esculetin (n=9)

2.3.9样品测定 分别精密称定藏骨宝胶囊的3批样品(130601,130802,131001)各0.5 g,每批3份,按照2.3.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.3.1项下色谱条件进样测定,计算秦皮甲素和秦皮乙素的总含量。结果表明,3批样品中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量分别为0.51,0.53和0.52 mg·g-1。

3 讨论

藏药质量标准的制定与完善在思路和方法上与中药类似,后者的研究思路与技术为藏药质量标准的研究提供了借鉴。藏药质量标准的建立既能保持藏药的特色,也有利于促进各民族医药的交流和发展。

在藏骨宝胶囊质量标准的制定中,TLC法对区分药材的真伪提供了定性的依据。其中土木香内酯的TLC中,考察了样品在甲醇中超声和静置后的斑点情况,得出超声提取的效率更高,斑点显色更清晰；在土木香内酯的TLC中,将原有的展开剂环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)改为现在的甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5),斑点显色清晰,分离度好,专属性强。

在处方中,秦皮的配比占最大,秦皮的有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素,故实验中考察了秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定方法[15-18]。HPLC法在对秦皮中的秦皮甲素和秦皮乙素进行定量测定时,对流动相配比进行了考察,结果以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)为流动相,此流动相中秦皮甲素和秦皮乙素对杂质峰的分离度较好,保留时间适宜,故选其为流动相。故将此含量测定方法纳入本质量标准。

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