秀丽莓中鞣花酸的含量测定和抗氧化活性评测及对接研究

刁玉林,朱冬青,刘 斌

(1.北京中医药大学中药学院,北京 100102；2.国家手性制药工程技术研究中心,山东鲁南制药股份有限公司,临沂 273400)

近年来,人们对鞣花酸的抗突变、抗癌变作用及其对化学物质诱导癌变的抑制作用进行了大量研究。在对鼠和人体组织移植所做的体内和体外实验中,鞣花酸对化学物质诱导的癌变及其他多种癌变,特别是对结肠癌、食管癌、肝癌[1]、肺癌、舌及皮肤肿瘤、乳腺癌[2]及鼻咽癌[3]等有很好的抑制作用。除抗癌作用外,鞣花酸还有抗病毒[4]、抗菌[5]、增强免疫活性[6]、抗增殖活性[7]、DNA损伤活性[8]及抗氧化活性[9]。目前,已有一些鞣花酸的初级产品面世,效果较好。近年来,互联网上广泛流传的Graviola因含有鞣花酸,能以104倍的效率杀死癌细胞,对乳癌、肠癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、宫颈癌、皮肤癌和胰腺癌的治疗有明显效果。已有中国公司生产Graviola萃取物,产品销往欧美国家。值得注意的是,Cozaa G等[10]以Casein kinase 2(CK2)为靶酶,与2 000种天然药物中的活性成分进行分子对接,发现鞣花酸是CK2目前已知最强的抑制剂。综上所述,鞣花酸是一种活性极强的有效成分,研究表明其为某些药材的主要有效成分,而秀丽莓水煎液中含有大量鞣花酸,提示可将鞣花酸视为秀丽莓指标性成分进行研究。因此,本实验开展了秀丽莓中鞣花酸的含量测定实验,建立了一种高效、准确的鞣花酸定量方法,可为秀丽莓的进一步开发利用及质量控制提供实验依据。值得注意的是,在原核和真核生物中广泛存在着一类属抗氧化蛋白超家族的过氧化物酶(Peroxidase)—Peroxiredoxin (Prx),该抗氧化蛋白在过氧化氢介导的信号通路调节中起重要作用。在哺乳动物细胞中,Prx家族成员能催化细胞内的过氧化氢还原,将其烷化成水和乙醇而清除[11-12]。因此,本研究首次采用计算机分子模拟的方法,选取与人类抗氧化活性相关的蛋白为受体研究对象,鞣花酸为配体,通过分子对接模拟,在分子水平上阐述其可能的作用机制并通过DPPH·抗氧化实验对其结果进行检验。

1 含量测定

1.1仪器与试药

1.1.1仪器 Waters高效液相色谱仪,配置为：1525型二元高压梯度泵系统,2998型PDA检测器,2414型柱温控制系统和2707型自动进样系统(美国Waters公司)；BT 25S型1/100 000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；龙尼柯UV-2000型紫外分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)。

1.1.2试药 鞣花酸对照品(南京奥多福尼生物科技有限公司,批号130412,质量分数>99.8%)。乙腈,色谱纯(德国Merck公司)；蒸馏水购买于屈臣氏；DPPH·(东京化成公司)；其他试剂为分析纯,购自北京北化精细化学品有限责任公司。秀丽莓采自青海互助北山,经青海省药品检验所藏药室主任罗桂法副主任药师和北京中医药大学刘春生教授鉴定为蔷薇科悬钩子属秀丽莓(RubusamabilisFocke)的干燥茎。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件与系统适用性实验 色谱柱：SunFireTMC18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-4 mL·L-1磷酸水溶液(20∶80)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃。依照上述色谱条件,精密吸取鞣花酸对照品溶液与供试品溶液各20 μL,进样。色谱图见图1。由图1可知，对照品溶液和供试品溶液所得色谱图相应位置上,有tR(min)相同的色谱峰,且样品中主成分色谱峰与其他干扰峰分离良好,无干扰,该方法适用于秀丽莓提取液中鞣花酸的含量测定。

1.2.2对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸对照品适量,加少量DMSO溶解后,加体积分数为60%的甲醇配制成鞣花酸质量浓度为20.48 μg·mL-1的溶液,即得。

1.2.3供试品溶液的制备 取秀丽莓细粉0.4 g,过40目筛,精密称定,置于100 mL锥形瓶中,精密加入体积分数为60%的甲醇25 mL,称定质量,超声45 min,静置,放冷至室温,再称定质量,用体积分数为60%的甲醇补足减失的质量,摇匀,以0.45 μm微孔滤膜滤过,得药材提取液,备用[13]。

图1HPLC图

A.对照品；B.样品；1.鞣花酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference；B.sample；1.ellagic acid.

1.2.4线性关系考察 分别精密吸取鞣花酸对照品溶液4,8,12,16,18和20 μL，注入液相色谱仪,按照1.2.1项下色谱条件测定色谱峰峰面积。以进样量(μg)为横坐标(x)、色谱峰峰面积为纵坐标(y),进行线性拟合绘制标准曲线,计算得鞣花酸回归方程为：y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),结果表明,鞣花酸质量在0.081 92～0.409 60 μg范围内线性关系良好。

1.2.5精密度考察 分别精确移取供试品溶液20 μL,连续进样6次,测定色谱峰峰面积,计算得色谱峰峰面积RSD值为0.99%(n=6),结果表明,该方法精密度良好。

1.2.6重复性考察 精密称取同一秀丽莓细粉6份,每份0.4 g,按照1.2.3项下方法制备供试品溶液,精确移取各样品提取液20 μL,注入液相色谱仪,测定每份药材中的鞣花酸的色谱峰峰面积,最终计算得鞣花酸的平均含量为0.080 98%(RSD值为0.92 %),结果表明,该方法重复性良好。

1.2.7稳定性实验 取1.2.3项下制备的试品溶液,室温下静置,分别于制备后0,2,4,6和8 h精确取样20 μL,注入液相色谱仪,测定各时间点处对应的鞣花酸色谱峰峰面积,计算RSD值为1.18%。结果表明,供试品溶液在8 h内稳定性良好。

1.2.8加样回收率实验 精密称取已知含量的秀丽莓细粉(鞣花酸质量分数为0.080 98%)6份,每份0.2 g,分别置于25 mL锥形瓶中,加入7.5 mL质量浓度为20.48 μg·mL-1的鞣花酸对照品溶液。按照1.2.3项下方法制得加样回收率测定溶液,精密吸取上述溶液20 μL,注入液相色谱仪,测定色谱峰峰面积并计算鞣花酸的含量和加样回收率。最终计算得鞣花酸的平均回收率为99.51%,RSD值为2.00%。结果见表1。

表1鞣花酸回收率实验结果

Tab.1 Results of the recovery test of ellagic acid

样品称样量/mg样品鞣花酸含量/μg添加鞣花酸量/μg测得鞣花酸总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%215.2174.269153.569320.84397.8799.512.00216.1174.998153.569323.63598.50214.6173.783153.569325.03999.29206.6167.305153.569328.580102.40204.8165.847153.569324.005101.44222.8180.423153.569325.75397.53

1.2.9样品测定 精密称取秀丽莓细粉3份,每份0.45 g,分别置于25 mL锥形瓶中,按照1.2.3项下方法制备样品溶液。分别精密吸取上述待测样品溶液和对照品溶液20和10 μL,注入液相色谱仪,测定色谱峰峰面积,采用外标一点法计算鞣花酸的含量,测得3批药材中鞣花酸的含量分别为0.802 7‰(RSD=0.99%),0.783 8‰(RSD=0.82%)和0.785 9‰(RSD=2.25%),平均含量为0.790 8‰,提示该药材中含有大量的鞣花酸。

2 分子模拟

2.1软件与算法 Discovery Studio 3.5软件,首先以LigandFit算法初步筛选适合该化合物的受体蛋白,再以CDOCKER算法分析其可能的作用机制,最终以TOPTAK模块计算化合物的毒理学数据,对化合物进行全面评估。

2.2方法与结果 本实验选取在Protein Data Base

(PDB)数据库中全部与人体内抗氧化活性相关的PrxⅠ、PrxⅡ(包括属于Ahpc/TSA系的Alkyl hydroperoxide reductase subunit C与同属于Ahpc/TSA系,TDXH亚系的Probable peroxiredoxin)、Prx Ⅳ及PrxⅤ下的若干蛋白为受体研究对象,见表2。以鞣花酸为配体,通过LigandFit法对以上受体进行活性初筛。

表2受体选择结果

Tab.2 Selected results of receptors

蛋白系PDB蛋白图库编码PrxⅠ1QQ2,2RⅡ,2Z9S,3HY2Alkylhydroper-oxidereductasesubunitC1N8J,1TP9,1YEP,1YEX,1YF0,1YF1,2BMX,3EMP,4G2EProbableperox-iredoxin1X0R,1ZOF,2CV4,2E2G,2E2M,2NVL,2ZCT,3A2V,3A2W,3A2X,3A5WPrxⅣ2pn8,3TJB,3TJF,3TJG,3TJJ,3TJK,3TKP,3TKQ,3TKR,3TKS,3VWU,3VWV,3W8JPrxⅤ1H4O,1HD2,1OC3,1URM,2VL2,2VL3,2VL9,3MNG

在LigandFit实验结果基础上,对各蛋白与配体集中化合物的结合情况进行打分评价,根据一致性评分(Concensus percentage)由高至低排列筛选,最终确定结合最优的受体蛋白为1URM(Concensus percentage=100),选取维生素C为阳性对照药物,以Prx Ⅳ系中的1URM蛋白为受体,进行模拟计算后所得结果见图2。

图2分子模拟结果示意图

A.1URM蛋白结构及作用空腔位置；B.阳性药维生素C与蛋白结构碱基空间作用；C.鞣花酸与蛋白结构碱基空间作用。

Fig.2 The sketch map of the results of molecular simulation

A.the structure of protein 1URM and the effective cavity position；B.the dimensional effects between positive drug,vitamin C and basic groups of protein；C.the dimensional effects between ellagic acid and basic groups of protein.

分析发现,受体蛋白A链上的Arg86碱基的HH21位点与阳性药维生素C通过1位羰基上的氧原子间(XYZ：22.956,45.244,18.544；键长1.991 74 Å；Donator Hydrogen Acceptor(DHA)角141.869°；Hydrogen Acceptor Y-axis(HAY)角117.172°)；2位-OH上的氢原子与A链上Glu91碱基的OE1位点间(XYZ：22.714,41.389,15.748；键长2.262 86 Å；DHA角 127.198°；HAY角106.207°)；3位-OH上的氢原子与A链上Glu91碱基的OE1位点间(XYZ：21.934,40.794,15.855；键长2.121 26 Å；DHA角 118.012°；HAY角101.376°)及6位-OH上的氢原子与A链上82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子间(XYZ：21.555,43.157,22.052；键长2.192 49 Å；DHA角 144.639°；HAY角124.388°)之间形成共4个氢键而与受体蛋白相结合,最终起相应的抗氧化作用。

鞣花酸与该蛋白相互作用主要通过氢键及π-π相互作用实现：通过3位的-OH上的氢原子与受体蛋白A链上的82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子间(XYZ：21.594,43.24,22.05；键长2.132 29 Å；DHA角 129.146°；HAY角121.32°)；受体蛋白A链上的Arg86碱基HH21位与4位的氧原子间(XYZ：22.675,44.841,18.553；键长2.435 69 Å；DHA角145.334°；HAY角114.141°)；受体蛋白A链上的Gly92碱基HN位与10位羰基上的氧原子间(XYZ：19.827,38.584,15.479；键长2.285 29 Å；DHA角 143.958°；HAY角108.646°)形成氢键。同时,7,8-二羟基所在苯环与受体蛋白A链上的Arg95碱基NE位间(XYZ：18.889,43.08,13.577；键长4.650 74 Å)；10位羰基所在的苯环与受体蛋白A链上的Arg95碱基NE位间(XYZ：18.527,42.183,14.311；键长4.657 09 Å)均存在π-π相互作用,最终共同作用于该蛋白,起相应抗氧化效果。鞣花酸可与受体蛋白间形成3个氢键及2个π-π相互作用键。综合考虑键长、键的类型与数量等因素后认为,鞣花酸的抗氧化活性较阳性药维生素C强。

经计算,鞣花酸在全部模型中的有效可信结果为：①在NTP数据集中的雌性小鼠致癌率为0,即不致癌；②致突变性(Ames Mutagenicity)比例为0；③大鼠口服LD50值：Computed Rat Oral LD50Log (1/Moles)=2.183；Computed Rat Oral LD50=2.0 g·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=327.7 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=10 g·kg-1；④大鼠长期口服最低毒性和不良反应水平(Lowest Observed Adverse Effect Level,LOAEL)：Computed Chronic LOAEL Log (1/Moles)=3.052；Computed Chronic LOAEL=268.1 mg·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=51.0 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=1.4 g·kg-1；⑤皮肤刺激性(Skin Irritancy)：可能性为0,即无皮肤刺激性；⑥眼刺激性(Ocular Irritancy SEV vs MOD)可能性为0,即无眼刺激性。

3 抗氧化活性测定

3.1仪器与试药 与1.1项下相同。

3.2方法与结果

3.2.1溶液的配制 DPPH·溶液的配制：取DPPH· 1 mg溶于20 mL无水乙醇中,超声5 min,充分振摇使混匀，即得。取1 mL DPPH·溶液,在519 nm波长处测定吸光度值A。该DPPH·溶液避光保存,3.5 h内用完。

样品溶液的配制：样品以合适的溶剂溶解,为便于计算,可配成与阳性药效果近似的质量浓度。溶剂根据样品的极性进行选择,如不溶可用DMSO助溶。

3.2.2数值的测定A0值的测量：取3.2.1项下制备的DPPH·溶液2 mL,置于小试管或玻璃瓶中,加甲醇1 mL,混匀,在519 nm波长处测定吸光度值A0(A0多在0.7～0.9之间)。A值的测量：取3.2.1项下制备的DPPH·溶液2 mL,加入小试管或玻璃瓶中,加样品溶液xμL,再加(1 000-x)μL甲醇,混匀,静置30 min后,在519 nm波长处测定吸光度值A。

3.2.3实验方法与结果 本实验选取维生素C为阳性药物对照,精密称定2.0 mg维生素C,以甲醇为溶剂配制成25 mL的储备液(质量浓度为80 μg·mL-1),依次取该溶液40,80,120,160,200,240,280和320 μL,加入甲醇分别定容至体积为1 mL后，按照3.2.1和3.2.2项下方法进行测定。各样品均配制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液,以相同方法测定,实验结果见表3～4。

表3阳性药维生素C的DPPH·抗氧化活性

Tab.3 The anti-oxidation effect of the positive drug vitamin C by DPPH· method (n=3)

表4鞣花酸的DPPH·抗氧化活性

Tab.4 The anti-oxidation effect of ellagic acid by DPPH· method (n=3)

根据以上数据,计算维生素C与鞣花酸的IC50值分别为8.881和3.371 μg·mL-1,可见鞣花酸的抗氧化能力为维生素C的2.6倍,与预测结果一致。

4 讨论

藏药秀丽莓为悬钩子属植物,该属植物化学成分的系统研究始于20世纪70年代末80年代初,迄今为止,国内外学者已从该属30余种植物中分离得到多种化学成分,主要包括黄酮、萜、鞣质、甾以及少量醌、有机酸、生物碱等[14]。该药材具有清热解毒和提高机体免疫的作用,在藏医治疗感冒、发烧、咳嗽、瘟热病的方中,常单独或配伍其他药组成清热解毒方使用[15]。目前临床多用于预防和治疗流感、肺热咳嗽、气喘和胃溃疡等,疗效确切可靠[16]。本课题组在前期研究中发现秀丽莓提取物中含有大量酚酸[17-18]及糖[19]类成分,提示该药材的临床疗效极有可能与此类物质有关。基于以上实验结果,本实验建立了秀丽莓中鞣花酸的HPLC含量测定方法及其抗氧化活性研究。

4.1含量测定 鞣花酸的回归方程为y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),在0.081 92～0.409 60 μg质量范围内线性关系良好,精密度RSD=0.99%(n=6),8 h内测定峰面积RSD值为1.18%,重复性考察RSD=0.92%(n=6),平均加样回收率为99.51%(RSD=2.00 %,n=6)。结果表明,该方法操作简便,测定结果准确、稳定、重复性好,适用于秀丽莓中该成分含量的测定。按照该方法对3份药材进行测定,最终测得药材中鞣花酸的平均含量为0.790 8‰。

4.2分子模拟 本实验证明秀丽莓水煎液中的鞣花酸可通过结构中的酚羟基以氢键、苯环经π-π键作用的方法与受体蛋白的氨基结合起效。结果显示,该成分具有较维生素C更强的抗氧化活性,同时结合TOPTAK毒性预测结果发现,鞣花酸无致癌、致突变性且对眼无刺激性。结果表明,开发秀丽莓的保健活性应主要从秀丽莓小分子中的抗氧化活性成分——鞣花酸开展。

4.3抗氧化活性的测定 经检测鞣花酸抗氧化活性较阳性药物维生素C强2.6倍,从而验证了LigandFit初步筛选结果的准确性与CDOCKER机制解释的可信性,从而证明鞣花酸可能为该植物中最重要的抗氧化活性成分。

综上所述,本实验通过有机结合含量测定、计算机分子模拟及体外抗氧化活性评价,对秀丽莓水煎液中的鞣花酸进行研究,该结果可为藏药秀丽莓中抗氧化成分鞣花酸的含量检测及质量控制提供依据,也可为民族药物的进一步开发提供新思路。

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