脲对Flt3配体包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用研究

余秀娟，张如月，卢金铭

(1.河北北方学院药学系，河北 张家口 075000；2.华北电力大学科技学院，河北 保定 071000)

脲对Flt3配体包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用研究

余秀娟1，张如月1，卢金铭2

(1.河北北方学院药学系，河北 张家口 075000；2.华北电力大学科技学院，河北 保定 071000)

目的研究小分子脲对包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用。方法考察在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)流动相中添加脲时，不同浓度的小分子脲对包涵体蛋白重组人酪氨酸激酶配体(recombined human Flt3 ligand,rhFL)复性效率的影响，并采用荧光光谱技术，进一步研究目标蛋白Flt3复性前后复性效果变化与荧光强度变化的规律。结果当脲的添加浓度为3 mol·L-1时，rhFL的质量回收率达到33.1%，更易于恢复其天然构象及生物活性。结论添加适当浓度的脲可促进rhFL的复性与同时纯化，通过荧光光谱技术可以初步推测包涵体蛋白在复性过程中生物活性的变化，为rhFL蛋白药物的研发提供参考。

高效疏水相互作用色谱法；脲；Flt3配体；包涵体蛋白质；体外复性

Flt3配体(Flt3 ligand，FL)是一类在骨髓基质细胞和造血细胞中表达，刺激早期造血因子生长的具有很强协同作用的造血生长因子。人Flt3配体分子主要分布在初级淋巴细胞和次级淋巴细胞中[1-2]，由4个半胱氨酸残基形成2个分子内的二硫键，使整个分子折叠形成四螺旋的结构域，每一个螺旋都由β-折叠相连接。经探索，人们利用重组DNA技术在大肠杆菌(E.coil)中成功地表达了rhFL，发酵所得的产物主要以不溶的包涵体形式存在，通过对其氨基酸进行分析，结果显示rhFL具有自身的荧光性质，可作为实验的模型蛋白进行研究。

在实际应用中，包涵体可利用其不溶性及高度的致密性来促进纯化，但聚集形式的存在导致包涵体蛋白质的复性难度增加。传统的稀释法可以降低高浓度蛋白的复性难度，有效降低蛋白的复性浓度，获取少量蛋白质的复性产物，但却不能大规模应用于生产，所以如何有效地解决E.coil中过度表达的包涵体产物的体外复性问题成为生产的关键单元[3]。近些年来，越来越多的包涵体蛋白质采用液相色谱法(LC)进行复性与同时纯化并且获得了成功，LC法具备能够快速地除去变性剂、使复性蛋白质易与错误蛋白分离、易于自动化和耗时少等优点，达到了包涵体蛋白体外复性的技术要求[4]。

大量资料显示，HPHIC作为一种理想的包涵体蛋白体外复性的液相色谱法，其流动相为盐-水体系，该体系可使水化的变性蛋白瞬时失水，形成的局部结构有利于变性蛋白的折叠，分辨率较高，为包涵体蛋白的复性过程提供了良好的折叠环境[5]。本实验采用的HPHIC法，考察了在流动相中添加不同浓度的小分子脲时，对rhFL包涵体蛋白复性与同时纯化效率的影响，通过荧光光谱技术，总结了目标蛋白复性前后复性效果与荧光强度变化规律的关系，为rhFL蛋白药物的研发奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪LC-10A(岛津，日本)；可变波长紫外可见光检测器1PD-20AVP(岛津，日本)；N2000色谱工作站(浙江大学)；F-4500荧光光谱仪(日立，日本)；PB-10型pH计(Sartorius公司，德国)；SORVALL RC28S离心机(Sovall公司，美国)；UV-1700紫外可见分光光度计(岛津，日本)；AUW220型分析天平(岛津，日本)；国华THZ-82摇床(国华电器有限公司，苏州)。

蛋白质分子量标准(marker)(分析纯，美国Sigma公司)；二硫苏糖醇(DTT)(分析纯，Wolsen公司)；脲(urea)(分析纯，Wolsen公司)；考马氏亮蓝R-250(电泳纯，Fluka公司)；考马氏亮蓝G-250(分析纯，Fluka进口分装)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、硫酸铵(NH4)2SO4、溴酚蓝、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)(均为国产分析纯)。

1.2 色谱条件

流动相A：50 mmol·L-1KH2PO4，3.0 mol·L-1(NH4)2SO4，pH 7.0；流动相B：50 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.0，过滤后使用。采用填料为硅胶基质的HPHIC色谱饼(10 mm×20 mm I.D.)，配基为苯基型，填料的平均孔径为30 nm，实验室自行合成并装填。在波长为280 nm和2.0 mL·min-1流速条件下，进样200 μL至已用100%流动相A平衡过的色谱饼上，再进行30 min的线性梯度洗脱，直至流动相B液为100%，并持续洗脱15 min，使色谱饼再生，最后用100%流动相A液使色谱饼平衡，从而构成一个完整的色谱过程。

1.3 FL蛋白的发酵培养

1.3.1 种子液的制备

将重组质粒转化到宿主E.coli细胞获得的工程菌，按2%(V/V)比例接种于LB培养基(含Amp+，100 μg·mL-1)中，在30 ℃、200 r·min-1条件下培养过夜。

1.3.2 摇瓶中菌种的培养

次日，按一定比例将种子液转接于含有培养基(Amp+)的三角瓶中，继续培养至一定的细胞浓度(A600约为0.8)，加入IPTG(终浓度为0.6 mmol·L-1)进行诱导表达若干个小时。

发酵所配试剂以及FL蛋白发酵培养的具体方法参见文献[6]。

1.4 rhFL包涵体的回收与溶解

1.4.1 主要缓冲液的组成

缓冲液Ⅰ：20 mmol·L-1PBS，1 mmol·L-1EDTA-Na2，pH 7.4；缓冲液Ⅱ：1.0 mol·L-1脲，1 mmol·L-1EDTA-Na2，0.5 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1PBS，pH 7.4；包涵体的溶解液：8.0 mol·L-1脲，50 mmol·L-1DDT，1 mmol·L-1EDTA-Na2，pH 8.0。

1.4.2 rhFL包涵体的复性前预处理

称取一定量的rhFL发酵产物，加入10 mL·g-1的缓冲液Ⅰ进行洗涤。室温下搅拌均匀，将得到的菌体置于冰水浴中超声破碎，设定超声破碎仪的能量不低于30%，破碎时间为30 min，每破碎7.0 s，停7.0 s。再在温度为4 ℃、转速为10 000 rpm的条件下离心20 min，弃去上清液，收集沉淀部分，即为rhFL包涵体。

获得的rhFL包涵体中加入10 mL·g-1的缓冲液Ⅱ，室温下搅拌约30 min。在温度为4 ℃、转速为10 000 rpm的条件下离心20 min，弃去上清液，收集沉淀部分。反复用缓冲液Ⅰ洗涤一次、缓冲液Ⅱ洗涤两次，在温度为4 ℃、转速为10 000 rpm的条件下离心20 min，弃去上清液，获得初步纯化的rhFL包涵体蛋白质。

1.4.3 包涵体的溶解

向获得的初步纯化的rhFL中加入10 mL·g-1的包涵体溶解液，置于温度为4 ℃的冰箱中12 h以上。再在温度为4 ℃、转速为12 000 rpm条件下离心20 min，上清液即为实验所需的rhFL变性抽提液，置于温度为4 ℃的冰箱中保存，用于后续蛋白的复性研究。

1.5 分析与鉴定rhFL复性与同时纯化的效果

1.5.1 rhFL的质量回收率

采用Bradford法测定从HPHIC色谱饼收集的色谱馏分中的蛋白质含量，以BSA为标准，目标蛋白质量回收率计算见文献[6]。

1.5.2 rhFL的荧光光谱分析

将色谱馏分收样得到的各目标蛋白馏分采用荧光光谱仪进行荧光光谱的测定。激发波长为280 nm，扫描速率1200 nm·min-1，激发光和发射光的狭缝宽度均5 nm。测定各复性条件下的荧光发射光谱图。

2 结 果

基因在E.coli中高效表达得到的是错误折叠的包涵体蛋白且大多不具有生物活性。本实验所用的rhFL包涵体蛋白也是E.coli中高效表达得到的，且主要以不可溶和无活性的形式存在。为得到正确折叠的蛋白质，必须进行包涵体蛋白的体外辅助复性[7]。实验采用固定相以苯基为配基的分析型色谱饼，并在色谱流动相中添加小分子脲进行rhFL的复性与同时纯化。图1是在流动相中添加0～4.0 mol·L-1脲时HPHIC色谱饼上复性与同时纯化rhFL包涵体的色谱图。图1显示，随着流动相中脲浓度的增加，色谱峰逐渐升高，当脲浓度为3.0 mol·L-1时，色谱峰的变化最大，之后逐渐平缓。

图1 不同脲浓度时rhFL HPHIC复性与纯化的色谱图(为目标峰)

色谱条件：流动相A:3.0 mol·L-1(NH4)2SO4,0～4.0 mol·L-1urea,50 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.0);流动相B:0～4.0 mol·L-1urea,50 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.0);流速:2.0 mL·min-1;进样体积:200 μL。

出峰顺序：Line 1:0 mol·L-1urea;Line 2:1.0 mol·L-1urea;Line 3:2.0 mmol·L-1urea;Line 4:3.0 mol·L-1urea;Line 5:4.0 mol·L-1urea。

收集不同脲浓度下目标峰的色谱馏分，测定其蛋白质含量并计算质量回收率(图2)。图2显示，当脲浓度为3.0 mol·L-1时，质量回收率最高可达33.1%。根据变性蛋白质的各异性，添加适当浓度的脲利于变性蛋白向天然态构象折叠。

图2 不同脲浓度时rhFL HPHIC复性与纯化的质量回收率

对色谱饼上复性与同时纯化的目标馏分进行构象变化的进一步荧光光谱表征(图3)。当添加的脲浓度为3.0 mol·L-1时，荧光强度最低，说明此时目标蛋白质的构象最接近其天然态的构象，该结果与其获得的质量回收率结果一致。因此，在流动相中添加适当浓度的脲可以促进rhFL色谱法的复性与纯化，其色谱峰的变化、质量回收率的提高和荧光强度的改变，均可说明添加3.0 mol·L-1脲时更适合目标蛋白的复性。

图3 不同浓度L-Arg时rhFL HPHIC复性与纯化的荧光光谱变化

出峰顺序：Line 1:0 mol·L-1urea;Line 2:1.0 mol·L-1urea;Line 3:2.0 mmol·L-1urea;Line 4:4.0 mol·L-1urea;Line 5:3.0 mol·L-1urea。

3 讨 论

本实验采用HPHIC法，考察了在流动相中添加不同浓度的小分子脲对rhFL包涵体蛋白复性与同时纯化效率的影响。结果发现，3 mol·L-1的脲浓度为最佳结果，rhFL的质量回收率可达33.1%，易于恢复目标蛋白的天然构象及生物活性。利用荧光光谱技术，对比完全变性时和复性后蛋白的荧光强度，若复性后蛋白的荧光强度降低，说明此时蛋白的构象发生了转变，在一定程度上变性蛋白得到了复性。利用得到的质量回收率与荧光强度的变化关系，可以初步推测包涵体蛋白质在复性过程中生物活性的变化，为rhFL蛋白质药物的研发提供了参考。

[1] DAMDINSUREN A,MATSUSHITA H,ITO M,et al.FLT3-ITD drives Ara-C resistance in leukemic cells via the induction of RUNX3[J].Leuke Res,2015,39(12):1405-1413.

[2] MCCLANAHAN T,CULPEPPER J,CAMPBELL D,et al.Biochemical and genetic characterization of multiple splice variants of the Flt3 ligand[J].Blood,1996,88(9):3371-3382.

[3] ZHANG Y L,CHEN S S,YANG K G,et al.Expression of nattokinase inEscherichiacoliand renaturation of its inclusion body[J].J Biotech,2016(231):65-71.

[4] VEMULA S,DEDANIYA A,THUNUGUNTLA R,et al.Simplified in vitro refolding and purification of recombinant human granulocyte colony stimulating factor using protein folding cation exchange chromatography[J].J Chromat A,2015,1379(11):74.

[5] BAUMGARTNER K,GRO HANS S,SCHüTZ J,et al.Prediction of salt effects on protein phase behavior by HIC retention and thermal stability[J].J Pharma Biomed Analy,2016,128:216-225.

[6] JIA J.Refolding and simultaneous purification of the recombinant human Flt3 ligand by protein folding liquid chromatography[D].Xi’an:Northwest University,2010.

[7] 王骊丽,耿信笃.源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展[J].中国科学B辑:化学,2009,39(8):711-727.

来稿日期：2017-05-16

张家口市科学技术和地震局项目(No.1521001A)，河北北方学院青年课题项目(No.Q2014022)

余秀娟(1984-)，女，河北张家口人，讲师，2016级博士，主要研究方向为蛋白药物的制备及其分离与纯化。

Q 78

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.12.003

李蓟龙]