马骨关节炎模型关节液中CTX-II含量变化的研究

马天文 ， 王冠颖 ， 李 玥 ， 李欣然 ， 姜仁礼 ， 宋霄鹏 ，张志恒 ， 白 荟 ， 李 新 ， 陈宇航 , 高 利

(1.东北农业大学动物医学学院 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验窒 ， 黑龙江 哈尔滨 150030；2.通辽市鲁北镇兽医站， 内蒙古 通辽 029100)

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性、渐进性、退行性膝关节疾病，是世界上导致残疾的主要疾病之一，主要涉及软骨、关节滑膜及软骨下骨，以关节周围疼痛及关节功能障碍为主要临床表现[1]。促进马OA发病的因素很多，其中正常的关节受到异常力的作用和异常的关节受到正常力的作用是主要影响的因素。目前OA 诊断主要依据临床症状和影像学方法，但早期OA患畜的确诊情况并不理想。随着分子生物学的发展，近年来国内外学者也致力于发现一些能够早期诊断并区分OA严重程度的相关生物学标记物(biomarker, BM)，通过对BM的研究与临床应用，希望可以在影像学改变出现前，对OA进行早期诊断，并且预测组织结构破坏发生的可能性及疾病进展，同时评估治疗效果[2]。

II型胶原羧基端端肽(C-telopeptide-of-CⅡ, CTX-II)是基质金属蛋白酶(MMPs)降解II型胶原的产物，为Ⅱ型胶原1/4片段的羧基端端肽，相对分子质量较小，对关节软骨破坏危险性的评估具有特异性[3]。CTX-II作为惟一可同时在血液、尿液和滑液中检测的标志物，其样品稳定性高，对常规临床检测更有意义，因此逐渐成为BM研究的热点[4]。本研究采用酶联免疫夹心法(Sandwich-ELISA)测定马骨关节模型关节液中不同时间点的CTX-II水平，探索CTX-II浓度与OA 发病程度的关系，为以后建立马OA的快速诊断技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用13匹蒙古马，年龄5～8岁，体重331～511 kg，购自黑龙江省肇东市某养殖场。在进入研究之前，所有马进行临床检查，腕关节摄影，跛行检查，对腕关节屈曲反应和滑膜积液的评估，以确保所有测量的变量都在正常参考范围内。并且每匹马分别进行体况评分[6]，得分均在4～6分之间。为了适应环境，在试验前两周，将马拴养在固定的马圈中，随意采食饲料，每日放马1次。

1.2 试剂 盐酸美沙酮、盐酸地托咪定、磷酸盐缓冲液(PBS)，均购自Sigma公司；马CTX-II成品ELISA试剂盒，购自Shsaimo公司；两性霉素，购自Amresco公司。

1.3 诱导OA模型 将13匹蒙古马随机分为两组，试验组8匹，造模组5匹。临床检查都在正常参考范围内，体况检测合格。用PBS将两性霉素B稀释为25 mg/mL。试验开始前，给马静脉注射盐酸美沙酮(0.1 mg/kg体重)和盐酸地托咪定(0.1μg/kg体重)，进行镇静。造模组在马左侧腕关节内注入2 mL无菌的两性霉素B稀释液，诱导马OA模型。对照组关节腔注入2 mL无菌的PBS。

1.4 样品采集及处理 在两性霉素B给药之前，收集所有马左侧腕关节的关节滑液0.5～1 mL。在整个研究期间每周收集0.5-1 mL滑液样品，直到第9周。将样品收集在没有任何添加剂的EP管中。收集的关节液1 h内离心15 min(10 000 r/min)，收集上清液，-80 ℃保存待用。从0周到9周每周次分别采用ELISA试剂盒测定造模组和对照组马关节滑液中CTX-II含量，严格按照ELISA试剂盒商家说明书操作。

1.5 临床指标的监测 每次收集关节滑液后，记录马的直肠温度，呼吸频率，脉搏和腕关节周长，并且进行马跛行评估，标准参照美国马兽医协会(AAEP)制定的跛行分级标准[5]进行评分。0级：健康状态；1级：不易发现跛行和行走障碍，间断性的跛行出现在特定的情况(如负重、转圈、斜面和硬地面)；2级：不易发现跛行，但行走异常。持续性跛行出现在特定的情况(如负重、转圈、斜面和硬地面)；3级：在任何情况下，都出现明显的跛行；4级：明显的跛行，并且伴随行走点头和步幅缩小；5级：明显的跛行，在最小的负重量的情况下，不愿移动或站立。

1.6 统计学分析 采用Social Sciences 19.0(SPSS Inc. USA)软件进行统计学分析，结果表示为MEAN±SD表示，使用单因素方差分析和t检验进行统计学比较。以P<0.05为差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 临床症状 两性霉素B注射后，造模组和对照组马的直肠温度、呼吸、脉搏都在正常的范围内。对照组的马在试验期间没有出现跛行症状，造模组的马在建立OA模型后的第1、2周表现出1级跛行，在第3、4、5周表现出2级跛行，在第6、7、8 周表现出3级跛行，在第9周表现出5级跛行。对照组的马关节周长平均为28.6 cm，在试验期间没有明显变化。造模组马的关节周长随着时间的延长而逐渐增加，第2周开始差异显著(P<0.05)，第3周至第9周差异极显著(P<0.01)(见图1)。

2.2 关节液CTX-II含量变化 如图2所示，与对照组相比，造模组从第1周开始，关节液中CTX-II的含量增加，之后第2周开始显著增加(P<0.05)，第4周开始呈极显著增加(P<0.01)并且保持增加的趋势直到第9周。

图2 马关节液CTX-II浓度(ng/mL)变化

*：差异性显著(P< 0.05)；**：差异性极显著(P< 0.01)

3 讨论

关节软骨是由软骨细胞及细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)构成的一种无血管、神经、淋巴组织分布的结缔组织。ECM主要包括胶原和蛋白多糖两种物质，II型胶原是构成基质的主要成分，也是维持基质稳定的重要成分[6]。因此，II型胶原作为最重要的软骨成分之一，其代谢产物水平成为监测软骨病理生理的改变研究的热点之一。CTX-II是一种II型胶原的降解产物，1987年Eyre等[7]在牛关节软骨研究中首次发现，为共价键组成的三螺旋片段，可在组织蛋白酶作用下产生小分子多肽。CTX-II完全来自成熟的结构胶原，并以小肽形式全部进入尿液[8]。Lohmander L S等[9]报道在关节损伤或OA发病后1周，关节液中CTX-II的含量就有明显的升高，最后逐渐下降到一个稳定的水平，而且在影像学发生病变的OA病例以及影像学未发现的早期OA病例，关节液中CTX-II的含量都有显著升高，其中影像学未发现的早期OA病例相比对照组升高3倍。Jonathan等[10]也报道在急性关节损伤后，关节液中CTX-II的含量有显著的升高。

马关节内注射两性霉素B建立OA模型同手术方法诱导OA模型相比，是具有快速、安全、简便等优点，同时避免了手术创口对试验的影响[11]。有研究表明，用此种方法成功诱导建立牛和驴的骨关节炎模型[12]。两性霉素B引起马跛行可能是由于其对软骨基质和滑膜的毒性作用引起炎症反应以及滑液分泌增多所导致的。OA以往的研究是采用影像学标准对马匹的病情程度进行评定[3]，然而影像学的改变并不能直观准确的反映软骨的病变程度，存在一定的误差，另外以往的研究中所检测的样本为病畜的血液或尿液[13]，这两种样本更大程度上反映的是全身性的代谢情况，并不能准确的反映局部关节软骨的病变程度，这些都有可能对试验结果造成影响。所以本研究通过检测膝关节液中II型胶原分解代谢产物中CTX-II含量，直接准确的探讨关节液中CTX-II浓度与关节软骨病变程度间的关系。在关于人OA的研究中发现，与正常关节相比，患病关节的关节液中CTX-II的量明显增加，而且浓度的增加程度与损伤程度有关[14]。在整个试验过程中，对照组关节液内CTX-II浓度无明显变化，造模组马关节液CTX-II浓度在注射两性霉素B后第2周开始显著增加(P<0.05)，在整个试验过程中关节液CTX-II浓度持续升高直至第9周试验结束。造模组在腕关节注入两性霉素B后第3周开始出现不同程度跛行，并且CTX-II浓度的升高在跛行前就已经出现了明显的显著性升高，这一结果与人OA病变过程中CTX-II变化趋势相符[14]。本试验结果早期浓度的显著性升高证明了软骨的降解早于临床症状的出现。CTX-II浓度的升高意味着II型胶原的降解，使ECM遭到破坏从而加重OA程度。

综上所述，推测关节滑液中的CTX-II可以作为潜在的马早期骨关节炎诊断的BM，为以后建立马骨关节炎的快速临床诊断技术提供理论依据。

[1] Hani A F, Kumar D, Malik A S,etal. Fusion of multinuclear magnetic resonance images of knee for the assessment of articular cartilage[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2013, 2013(7): 6 466-6 469.

[2] Atherton H J, Jones O A, Malik S,etal. A comparative metabolomic study of NHR-49 in Caenorhabditis elegans and PPAR-alpha in the mouse[J]. FEBS letters, 2008, 582(12): 1 661-1 666.

[3] Mokbel A N, Tookhy O S E, Shamaa A A,etal. Homing and reparative effect of intra-articular injection of autologus mesenchymal stem cells in osteoarthritic animal model[J]. Bmc Musculoskeletal Disorders, 2011, 12(1): 259.

[4] Dam E B, Loog M, Christiansen C,etal. Identification of progressors in osteoarthritis by combining biochemical and MRI-based markers[J]. Arthritis Research & Therapy, 2009, 11(4): R115.

[5] Ross M, Dyson S, Ross M,etal. Diagnosis and management of lameness in the horse[M]. Oxford, Elsevier LTD, 2011: 247-267.

[6] Cui N, Hu M, Khalil R A. Biochemical and Biological Attributes of Matrix Metalloproteinases[J]. Progress in Molecular Biology & Translational Science, 2017, 147: 1.

[7] Eyre D R, Apon S, Wu J J,etal. Collagen type IX: Evidence for covalent linkages to type II collagen in cartilage[J]. Febs Letters, 1987, 220(2): 337-341.

[8] Jch R, Garnero P. Biological markers in osteoarthritis[J]. Bone, 2007, 3(6): 346-356.

[9] Lohmander L S, Atley L M, Pietka T A,etal. The release of crosslinked peptides from type II collagen into human synovial fluid is increased soon after joint injury and in osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatology, 2003, 48(11): 3 130-3 139.

[10] Catterall J B, Stabler T V, Flannery C R,etal. Changes in serum and synovial fluid biomarkers after acute injury (NCT00332254)[J]. Arthritis Research & Therapy, 2010, 12(6): R229.

[11] Kotschwar J L, Coetzee J F, Anderson D E,etal. Analgesic efficacy of sodium salicylate in an amphotericin B-induced bovine synovitis-arthritis model[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(8): 3 731-3 743.

[12] Reijman M, Hazes J M, Bierma-Zeinstra S M,etal. A new marker for osteoarthritis: Cross-sectional and longitudinal approach[J]. Arthritis & Rheumatology, 2004, 50(8): 2 471-2 478.

[13] Sharif M, Kirwan J, Charni N,etal. A 5-yr longitudinal study of type IIA collagen synthesis and total type II collagen degradation in patients with knee osteoarthritis-association with disease progression[J]. Rheumatology, 2007, 46(6): 938.

[14] Jiang Q, Qiu Y, Chen M,etal. Synovial TGF-β1 and MMP-3 levels and their correlation with the progression of temporomandibular joint osteoarthritis combined with disc displacement: A preliminary study[J]. 2013, 1(2): 218-222.