禽腺病毒Ⅰ群C种4型病毒的荧光PCR诊断方法的建立

卢受昇 ， 孙彦伟 ， 余希尧 ， 高慧敏 ， 邓国东 ， 叶 健

(广东省动物卫生监督总所 ， 广东 广州 510230)

腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ群C种4血清型的病毒(Fowladenovirusserotype4, FAdV-4)是引起心包积水-肝炎综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)的病原，该病以传染性强，发病急、死亡率高为特征，近年来在北方一些省份流行[1-2]对生产造成较大的损失。该病首先于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发现，故又称安卡拉病。当前无商品化的诊断试剂，急需建立一种敏感性高、特异性强的实验室诊断方法，以提高本病的发现率,有关诊断方法建立情况介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ群C种4毒株GD01株，由本所分离鉴定。特异性检验用鸭瘟、小鹅瘟、传染性腔上囊炎、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒使用疫苗毒为广东永顺生物制药股份有限公司产品；禽流感H5、H9亚型HI抗原，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；新城疫、EDS76 HI抗原，购自中国兽医药品监察所。心、肝、脾、肺、肾、胸腺，喉头拭子、泄殖腔拭子等临床样品采自某鸡场可疑病死鸡[3]。荧光定量 PCR仪Lightcycle 480为罗氏公司产品；DNA柱式提取试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品；荧光PCR预混试剂PremixExTaq(Probe qPCR)为宝生物工程 (大连) 有限公司产品。

1.2 引物、探针的设计 以禽腺病毒hexon基因为检测靶区，设计特异性引物P1：5′-GACCCCCTACTGGATCATGGA-3′，P2：5′-GCTGGGTACGAGAGGCTGTTG-3′，TaqMan探针: 5′(FAM)-AATTACCTGGGAGCGGTGGCCG-3′(TAMRA),扩增的目的片段长90 bp。引物和探针由上海立菲生物技术有限公司合成。

1.3 引物和探针反应浓度的筛选 用20 μL PCR反应体系，结合预混试剂PremixExTaq的使用要求，其中引物终浓度设0.1、0.2、0.4 μmol/L，探针终浓度设0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L，采用矩阵法进行优化, 确定引物和探针的最佳配比浓度。

1.4 标准曲线的建立 以病死鸡肝组织RNA提取物作为标准品(因该病毒的鸡胚尿囊液病毒含量较低)，以10倍为梯度进行稀释，做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67个浓度，每个稀释度做3个重复，以起始模板数的对数为 X轴，Ct值(每个管内的荧光信号到达设定的阈值时需要的循环数)为Y轴做回归曲线，建立标准曲线。

1.5 敏感性试验 以病死鸡肝组织RNA提取物作为标准品(因该病毒的鸡胚尿囊液病毒含量较低)，以10倍为梯度进行稀释，做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共11个稀释度。同时用本方法和普通PCR方法进行平行检测。

1.6 特异性检验 用禽流感H5、H9 HI抗原、新城疫-传染性支气管炎疫苗、传染性腔上囊病减疫苗、减蛋综合征EDS-76 (禽腺病毒Ⅲ群)HI抗原、传染性喉气管炎疫苗、鸭瘟疫苗、小鹅瘟疫苗病毒以及鸡正常组织进行特异性检验。

1.7 临床样品的检测 对20份样品进行检测，其中临床发病鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑、气管、胸腺、心胞液、泄殖腔拭子样品各1份，同场临床正常鸡咽/肛拭子样品10份。在用本方法检验的同时，用普通PCR检测做平行对照。

2 结果

2.1 反应条件的确立 根据引物和探针反应浓度的筛选结果，以及预混试剂PremixExTaq使用说明书要求，确定反应体系和反应程序：PremixExTaq(2×)10 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL；探针(10 pmol/μL)1.6 μL；模板3 μL，DEPC水5.6 μL。反应程序为95 ℃预变性 2 min, 94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s, 5个循环；94 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环,60 ℃反应结束时收集荧光。

2.2 标准曲线的建立 以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67个浓度为 X轴，各梯度Ct值为 Y轴。得标准曲线，从标准曲线图可知，各浓度范围内有很好的线性关系, 扩增效率为1.959，见图1。

2.3 敏感性检验 从图2(A)可以看出可检出敏感性为10-7，说明本方法具有良好的特敏感性；同时用普通PCR方法进行检测作为对照，结果检测敏感性为10-4，见图2(B)。说明本方法较普通PCR方法灵敏度提高了1 000倍。

图2 敏感性检测结果

2.4 特异性检验 从图3可以看出禽流感H5、H9HI抗原、新城疫-传染性支气管炎疫苗、传染性腔上囊病减疫苗、减蛋综合征EDS-76 HI抗原、传染性喉气管炎疫苗、鸭瘟疫苗、小鹅瘟疫苗以及鸡正常组织结果均为阴性。说明常见的家禽疫病病原及正常的组织不会干扰本方法的检测结果，本方法具有良好的特异性。

2.5 临床样品的检验 20份临床样品用本方法检测结果为13份阳性。其中10份发病鸡组织样品均为阳性；同场临床正常咽/泄殖腔拭子样品中，3份阳性，7份阴性，结果见图4。普通PCR方法检测结果为10份组织样品中有6份阳性，4份阴性；同场10份鸡拭子样品均为阴性。说明本方法提高了灵敏性后，更有利于临床低病毒含量样品的检测。

3 讨论

3.1 当前对于FAdV-4的诊断主要通过普通PCR和病毒分离鉴定等常规方法，实时荧光定量PCR方法与常规的诊断相比，具有灵敏性高、特异性强、速度快、通量高等特点，在各种动物疫病的诊断中得到了广泛应用。文艳玲[4]建立了用于检测Ⅰ群禽腺病毒SYBR Green 荧光PCR方法。本研究中使用的TaqMan探针法，因增加了探针，从而进一步提高了特异性，更有利于临床样品的诊断。本方法敏感性比普通PCR提高了1 000倍，为该病的诊断及高通量监测提供了一个有效的技术手段。

3.2 本方法对临床组织样品检测中，检出10份，而普通PCR方法为6份，普通PCR则由于敏感性的限制，对一些病毒含量低的组织，或拭子样品，无法检出。该荧光PCR方法的建立，使采集拭子样品进行流行病学调查成为可能，并可对不同组织中病毒的含量进行相对定量，为该病毒组织嗜性等发病机理研究提供了一种便捷的方法。当前，因为FAdV-4病毒在鸡胚或细胞生长需要一个适应的过程，病毒浓度较低时不易培养成功，鸡胚培养的方法还不适用于流行病学调查，建立一种高敏感的病毒培养方法是今后要努力的一个方向。

[1] 韩新会. 鸡包涵体肝炎的流行特点和治疗[J].家禽科学, 2014, 5:45.

[2] 常维山，王涛. 鸡心包积液综合征(安卡拉病)病原分离检测[J].中国动物保健, 2015, 17(12):25-26.

[3] 卢受昇，孙彦伟，余希尧,等.黄羽肉鸡心包积水-肝炎综合征的诊断与防控[J].广东畜牧兽医科技, 2017, 42(1):24-26.

[4] 文艳玲，谢芝勋，王莹，等.Ⅰ群禽腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2008, 38(09): 753-756