T-SPOT联合CD4+T淋巴细胞计数早期诊断HIV/AIDS合并肺结核潜伏感染的诊断价值分析

李智勇 李永春 陈 焰 郭健文

广东省佛山市南海区人民医院，广东佛山 528200

T-SPOT联合CD4+T淋巴细胞计数早期诊断HIV/AIDS合并肺结核潜伏感染的诊断价值分析

李智勇 李永春 陈 焰 郭健文

广东省佛山市南海区人民医院，广东佛山 528200

目的探讨结核（TB）感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT）与CD4+T淋巴细胞计数联合应用对艾滋病（HIV/AIDS）合并肺结核潜伏感染（LTBI）早期诊断的价值。方法选取2014年7月～2017年4月我院人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性（+）感染者20例，其中合并LTBI的10例患者作为HIV（+）TB待排组，其余作为单纯HIV（+）组；HIV阴性（-）30例，合并LTBI 的10例患者作为HIV（-）TB待排组，其余作为单纯HIV（-）组。以诊断TB标准（病原学检验）做参照，以上述四组人员为对象，比较结核菌素实验（TST）和T-SPOT诊断TB 的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值，比较TST与T-SPOT诊断TB的一致性，以及CD4+细胞计数对两者的影响。结果T-SPOT在TB诊断中，灵敏度、特异度、准确度均明显高于TST，在HIV（+）TB待排组和HIV（-）TB待排组中，T-SPOT和TST诊断TB一致性良好（Kappa＞0.75）。CD4+T淋巴细胞计数增加能够引起T-SPOT与TST对TB诊断的灵敏度、特异性和准确性的明显增加，且T-SPOT优于TST。结论在AIDS合并LTBI人群中，T-SPOT对TB诊断的灵敏度、特异性和准确度均明显高于TST，且T-SPOT对TB的诊断价值随着CD4+T淋巴细胞计数增加而提高。

结核酶联免疫斑点试验；CD4+T淋巴细胞；结核病；诊断

R378.911

A

2095-0616（2018）01-22-04

广东省佛山市医学类科技攻关项目（2014AB000582）。

Value of T-SPOT combined with CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of HIV/AIDS with latent tuberculosis infection

LI Zhiyong LI Yongchun CHEN Yan GUO Jianwen
Guangdong Province Foshan City Nanhai District People's Hospital,Foshan 528200,China

ObjectiveTo investigate the value of T-cell enzyme-linked immunospot assay (T-SPOT) for pulmonary tuberculosis(TB)and CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of acquired immunodeficiency syndrome(HIV/AIDS) with latenttuberculosis infection (LTBI).MethodsTwenty cases of human immunodeficiency virus (HIV)positive (+) patients who were admitted to our hospital during the period from July 2014 to April 2017 were enrolled in the study.10 cases with LTBI were included into HIV (+) TB for eliminationgroup and the other were included intosimple HIV (+) group.There were 30 HIV negative (-) cases,10 cases with LTBI were included into HIV (-) TB for eliminationgroup,and the other were included into simple HIV (-) group.With the diagnostic criteria of TB (etiological test) as the reference,the sensitivities,specificities,accuracy rates,positive predictive values,negative predictive values and the consistencies were compared between tuberculin skin test (TST) and T-SPOT in the diagnosis of TB.The influence of CD4+cell count on the two was also compared.ResultsThe sensitivity, specificity and accuracy of T-SPOT in diagnosis of TB were significantly higher than those of TST.In HIV (+) TB for eliminationgroup and HIV (-)TB for elimination group,the consistenciesof T-SPOT and TST are good in diagnosis of TB (Kappa＞0.75).The increase of CD4+T lymphocyte count can significantly increase the sensitivities,specificities and accuracy rates of T-SPOT and TST in the diagnosis of TB,and T-SPOT was better than TST.ConclusionThe sensitivity,specificity and accuracy of T-SPOT in the diagnosis of TB in patients with AIDS complicated with LTBI are significantly higher than those of TST,and the value of T-SPOT in the diagnosis of TB increases with the increase of CD4+T lymphocyte count.

T-cell enzyme-linked immunospot assay for pulmonary tuberculosis;CD4+T lymphocyte;Tuberculosis;Diagnosis

结核病（TB）是艾滋病患者常见的并发症，早期病原学阳性率低，不易被诊断，使艾滋病死亡率增高，目前在临床上使用的诸多方法中，均不能同时有效保障高灵敏度和高特异性[1]。通过进一步研究，近年来学者发现结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT）对TB的诊断有较高的灵敏度和特异度，但 CD4+T淋巴细胞计数对诊断结果有影响[2-4]。本研究以30例结核病患者与20例健康受试者为对象，对比T-SPOT与常规诊断方法结核菌素实验（TST）做对比，并结合CD4+淋巴细胞计数，综合诊断TB，以期为TB的诊断提供更准确的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年7月～2017年4月收治的30例HIV合并LTBI患者，按照临床症状表现分为三组，每组10例，无咳嗽、发热等结核病表现，但近期密切接触过活动性肺结核患者：病原学检测HIV病毒呈阳性，记为组1，HIV（+）TB待排组；HIV感染阴性，为组2，HIV（-）TB待排组。不来自结核病高发区域，不在结核传播高危环境工作且无活动性结核密切接触史和吸毒史，不合并其他脏腑器官疾病：病原学检测HIV病毒呈阳性，为组3，单纯HIV（+）组；HIV感染阴性，为组4，单纯HIV（-）组。组4由符合条件的我院20例健康医务人员组成。以上四组人员年龄，男女分别为36和24例，年龄20～50岁，平均（35.6±5.6）岁，四组人员在性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；对所有待检者进行血沉（ESR）、腺苷脱氨酶（ADA）、结核抗体、病原学和影像学检测。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT检测 按照试剂盒（英国Oxford Immunotec公司）说明书进行，取枸橼酸钠抗凝静脉血5mL，加入淋巴细胞抗原分离液，离心，取下层血样配制成细胞液，放入培养箱中培养，采用PBS洗板清晰，孵育，再用PBS清洗，加蒸馏水，烘干；结果判断：空白对照孔斑点数＞6，任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数大于6，记为阳性；空白对照孔斑点数＞6，任一实验孔斑点数大于空白孔斑点数的两倍也表示阳性，阳性结果即诊断为LTBI[2]。

1.2.2 结核菌素实验(TST) 取0.1mL体积的结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）（含5单位结核菌素，S10960016，北京祥瑞生物制品有限公司，50IU/mL，1mL/支）对患者行前臂尺侧皮内试验，72h后观察检测结果，判断标准：对HIV（+）患者，阳性反应为皮肤硬结直径≥5mm，对HIV（-）人员，阳性反应为硬结直径≥15mm[5]。

1.2.3 CD4细胞计数检测 采用流式细胞术，主要操作步骤：取标记抗体10uL，将测定标本加入后震动混匀，然后避光放置15～20min再加入溶血素（免洗）震动混匀，再避光放置15～20min后加入PBS平衡10S，最后将与测定标本等量的计数微球加入后上机测定即可[6]。

1.2.4 诊断标准 即病原学检测：清晨空腹留取每组人员痰液。取痰标本进行涂片后再抗酸染色（24h内），TB阴性：抗酸染色阴性；TB阳性：抗酸染色阳性[7]。

1.3 观察指标

以标准做参照，观察T-SPOT和TST对TB诊断的敏感度、特异度和准确度，计算阳性预测值和阴性预测值；观察CD4+T淋巴细胞计数对两者诊断TB的影响。

1.4 统计学分析

应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料以百分数表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TST、T-SPOT诊断结果与标准比较

分别收集应用TST法和T-SPOT法诊断各组中TB的阳性病例和阴性病例，并与采用金标准诊断的阳性病例和阴性病例对比。以金标准为100%诊断正确，当金标准为阳性，TST或T-SPOT为阳性，说明该方法诊断为真阳性；当金标准为阳性，TST或T-SPOT为阴性，说明该方法诊断为假阴性；当金标准为阴性，TST或T-SPOT为阳性，说明该方法诊断为假阳性，当金标准为阴性，TST或T-SPOT为阴性，说明该方法诊断为真阴性。以此评价TST和T-SPOT对TB诊断的灵敏度、特异度、正确度、阳性预测值和阴性预测值。见表1。

表1 TST、T-SPOT诊断结果与标准比较

表2 TST、T-SPOT诊断TB灵敏度、特异度和正确度比较（%）

表3 TST、T-SPOT诊断肺结核一致性分析结果

表4 CD4淋巴细胞计数对TST与T-SPOT的影响（%）

2.2 TST、T-SPOT诊断TB灵敏度、特异度和正确度比较

由表1数据，计算TST、T-SPOT诊断的灵敏度、特异度、正确度、阳性预测值和阴性预测值。与同组人员比较，T-SPOT诊断的灵敏度、特异度、正确度、阳性预测值、阴性预测值均明显高于TST，见表 2。

2.3 TST、T-SPOT诊断肺结核一致性分析

TST与T-SPOT在HIV(+)TB待排组一致性检验Kappa值为0.80，在HIV(-)TB待排组Kappa值为0.78，一致性均为良好（Kappa＞0.75）。见表3。

2.4 CD4淋巴细胞计数对TST、T-SPOT的影响

CD4+T淋巴细胞数目的增加，引起TST与T-SPOT检验灵敏度、特异性、准确度增加，同组比较可知，T-SPOT优于TST。见表4。

3 讨论

艾滋病是由于感染攻击机体CD4+T淋巴细胞的HIV病毒引起，HIV病毒入侵机体，会导致免疫系统瘫痪，为各种病原菌感染提供便利，较难治愈，死亡率较高，其中TB是艾滋病人群非常容易感染的并发症，能促进患者病情恶化，加速患者死亡，危害极大，对于免疫系统已经受损的机体来说，感染TB后，早期临床表现并不明显，此时称为结核潜伏感染（LTBI），结核杆菌在免疫系统低下的机体内能重新大量复制，出现临床症状时已经发展成了活动性肺结核[8]。因此，针对HIV合并TB的双重感染，及时诊断，就能避免延误治疗时机，及时切断病菌的进一步传播，降低死亡率。临床上TB传统诊断主要依靠涂片法、影像学检查、培养法、结核抗体法、血沉检查等，每一种检查方法都有明显的缺陷，诊断的可靠性较低[9-10]。作为TB检验金标准的病原学涂片，无法辨识死菌和活菌，对结核分枝杆菌及其分枝也不能较好的区分，而培养法耗时较长，除此之外，上述方法在HIV合并TB的患者中也不能获得较高的阳性率[11]。由于机体CD4+T淋巴细胞计数越低，患者临床症状表现越不明显，从而影响影像学诊断的正确率， ESR、结核抗体等不能检测患者血清中的所有结核抗体，且存在干扰[12]。TST所用PPD为混合蛋白，与卡介苗等非结核分枝杆菌（NTM）之间也能发生反应，导致在TB的诊断过程中出现假阳性率，受到免疫抑制剂的影响而出现假阴性率，同时，该实验主要依靠医务人员主观判读，容易存在一定的误差，导致诊断结果不够精确[13]。T-SPOT诊断TB感染是依靠酶联斑点杂交计数（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）检测体外活化的免疫细胞数，通过观察细胞数目变化，判断TB感染是否存在，该法以ESAT-6 和 CFP-10蛋白作为诊断抗原，刺激外周血淋巴细胞产生IFN-γ，较好的避开了普遍缺失这两种蛋白的 BCG和非结核杆菌的干扰，拥有很高的特异性，除此之外，该方法在体外进行试验，24 ～ 48h即可通过仪器客观判读结果，较快较好的降低误差率[14]。通过研究文献发现，目前对TB诊断的方法均能受到机体免疫状态的影响，机体最重要的免疫细胞CD4+T淋巴细胞，在HIV患者中大量被HIV病毒攻击，导致免疫反应不明显而不能很好的诊断HIV合并TB[15]。准确评估患者细胞免疫状况的关键，是快速精确的检测CD4+T淋巴细胞的计数，需采用最先进最准确的免疫检测方法，流式细胞术是目前最常用的，同时也符合本研究要求[11-12]。

本研究结果表明，T-SPOT与TST在HIV（+）TB待排组和HIV（-）TB待排组中诊断的一致性良好，CD4+T淋巴细胞计数增加会引起T-SPOT与TST对TB诊断的灵敏度、特异性和准确度提高，且T-SPOT明显优于TST。提示HIV（+）患者免疫功能低下，CD4+T淋巴细胞数目减少，对TST诊断结果造成较大偏差，使得T-SPOT检测结果更为可信。本研究结果与文献报道一致[9-12]。

综上所述，考虑到CD4+T淋巴细胞计数的影响，T-SPOT对HIV合并LTBI早期诊断比TST更有价值，值得在临床扩大应用。

[1] 陆建红，吴奕征，杨勇，等.结核T细胞酶联免疫斑点试验诊断结核性脑膜炎的应用价值[J].中国卫生检验杂志，2016，26（6）：816-818.

[2] 邹丹凤，肖和平，尹洪云.结核感染T细胞斑点试验在HIV/AIDS合并结核病诊断中的应用[J].同济大学学报(医学版 )，2015，36（5）：74-78.

[3] 罗丹，潘建华.T淋巴亚群及T-SPOT.TB检测对活动性结核病的鉴别诊断[J].中国热带医学，2015，15（4）：393-396.

[4] 柳明波，梁欣，翁国庆，等.(1，3)-β-D葡聚糖检测联合CD4+T 淋巴细胞计数对AIDS合并侵袭性真菌病的诊断价值 [J].检验医学，2015，30（8）：787-790.

[5] 叶魏，孟成艳，韩晓辉，等.酶联免疫斑点试验快速检测结核分枝杆菌感染的应用评价[J].中国国境卫生检疫杂志，2013，36（6）：361-364.

[6] 聂尚丹，王军，黄程，等.肺结核患者外周血CD4+T淋巴细胞凋亡的研究[J].中国病原生物学杂志，2013，8（4）：322-324.

[7] 陈少文，林翀，林明冠，等.结核分枝杆菌的病原学检测及耐药性分析[J].中国病原生物学杂志，2015，10（5）：446-449.

[8] 沈佳胤，卢洪洲.艾滋病合并结核病的防治研究进展 [J].中国艾滋病性病， 2015，21（6）：543-546.

[9] 崔哲哲，林玫，蓝如束，等.症状筛查与影像学检查在结核杆菌/艾滋病病毒双重感染监测中的应用评价[J].现代预防医学，2017，44（11）：2071-2075

[10] 钱宏波，郭蕊，赵汉东，等.γ-干扰素体外释放试验在艾滋病并发结核感染诊断中的应用价值探讨[J].现代检验医学杂志，2016，31（4）：35-37.

[11] 王爱彬，杨思园，蒋荣猛，等.结核感染T淋巴细胞斑点试验检测艾滋病合并结核病患者的敏感度及影响因素[J].中华传染病杂志，2016，34（11）：660-664.

[12] 谢静，邱志峰，韩扬，等.HIV/AIDS患者外周血CD4+T细胞计数和淋巴细胞计数相关性的多中心研究[J].中华内科杂志，2015，54（2）：118-121.

[13] CorbettEL,WattcJ,WalkerN,et al.The growing burden of Tuberculosis：globaltrends and interactions with the HIVepidemic.[J].Arch Intern Med，2003，163（9）：1009-1021.

[14] Talati NJ，Gonzalez-Diaz E，Mutemba C，et al. Diagnosis of latent tuberculosis infection among HIV discordant partners using interferon gamma release assays[J].BMC Infect Dis，2011，30（11）：264.

[15] Oni T，Gideon HP，Bangani N，et al.Risk factors associated with indeterminate gamma interferon responses in the assessment of latent tuberculosis infection in a high-incidence environment[J].Clin Vaccine Immunol，2012，19（8）：1243-1247.

2017-08-15）