濒危植物单性木兰外植体启动培养

杨梅　刘畅等

摘要：以单性木兰（Kmeria septentrionalis）种子、带有腋芽的茎段为外植体，以MS为基本培养基探讨不同消毒剂、消毒时间以及不同的培养基配方对单性木兰诱导不定芽及愈伤组织的启动培养研究。结果表明：种子外植体以37%NaCIO溶液联合0.1%HgCl₂溶液的效果优于75%乙醇联合0.1%HqCl₂溶液的消毒效果，且37%NaCIO10min+0.1%HqCl₂10min的消毒效果最佳，污染率为13.3%。带有腋芽的茎段作为外植体，75%乙醇50s+0.1%HgCl₂18min时消毒效果最好，污染率为9%。培养基MS+6-BA2.0mq/L+KT 2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L可以诱导腋芽和愈伤组织的生长，启动率是70%。

关键词：单性木兰；外植体；启动培养

单性木兰（Kmeria septentrionalis）为木兰科（Magno-liaceae）单性木兰属（Kmeria），是一级重点保护植物，主要分布于广西西北部的罗城、环江和贵州荔波县，生长在海拔300～500m的石灰岩山地林中，多数呈零散分布，成片分布仅见环江境内广西木论国家级自然保护区，面积大约3hm，现存成林树约为200株。其种源稀少，自然更新能力弱，结实率、产籽率低，传统的繁殖法繁殖倍数低，组织培养繁殖法可快速繁殖苗木。为此，对单性木兰进行了外植体的启动培养研究，以期为种群扩繁、保护及适度利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

单性木兰供试种子和茎段采自于广西武鸣县里建单性木兰基地。

1.2试验方法

1.2.1种子外植体和茎段外植体的消毒。选取饱满干净的种子用37%NaClO溶液消毒10min（分3组编号T₁、T₂、T₃）和75%乙醇溶液消毒10min（分3组编号T₄、T₅、T₆），无菌水冲洗后用0.1%HgCl₂分别消毒5、7、10min，再用无菌水冲洗；将采集处理好的茎段用75%乙醇消毒50s，无菌水冲洗后分为5组，编号T₂～T₁₁，用0.1%HgCl₂分别消毒8、10、15、18、20min，再用无菌水冲洗后将茎段切成带1个腋芽且芽两边各留Icm左右的茎段外植体。均接种在MS培养基上，每处理20瓶，重复3次。

1.2.2单性木兰茎段的启动培养。将无菌茎段外植体接种于不同启动培养基上（表1）。

1.3数据统计与分析

外植体接入培养基后，10～15d统计污染率和无菌活体得率，20～30d统计启动率和死亡率，观察生长状况。计算方法如下：污染率=（污染数/接种外植体总数）×100%；无菌活体得率=（无菌活体数/接种外植体总数）×100%；死亡率=（芽点或外植体干枯数/接种外植体总数）×100%；启动率=（腑芽萌动茎段数/无菌茎段数）×100%。

2结果与分析

2.1种子外植体的消毒

不同消毒处理对单性木兰种子外植体的消毒效果不同（表2），总体来看，37%NaCIO溶液+0.1%HgCl₂溶液的消毒效果优于75%乙醇联合0.1%HgCl2溶液的消毒效果，但2种消毒方式中都表现出随着消毒时间的延长，污染率下降的趋势。其中37%NaCIO溶液消毒10min联合0.1%HgCl₂溶液消毒10min的效果最佳，污染率为13.3%。由于多方面的原因，在经过60d的培养后未污染的种子中仍未有萌动迹象，后期可以进一步对其进行试验研究。

2.2茎段外植体的消毒

由表3可知，随着消毒时间的延长，外植体的污染率逐渐降低，其中以75%乙醇50s+0.1%HgCl₂溶液处理18min时污染率最低为9%。当时间延长至20min時，无菌活体得率为70.3%，死亡率为19.7%。说明消毒时间过短，污染率较高；消毒处理时间过长，对外植体毒害作用较大，以致无菌活体致死。故75%乙醇消毒50s+0.1%HgCl₂溶液处理18min的消毒效果最佳。

2.3单性木兰茎段的启动培养

将获得的带腋芽萌发点的无菌茎段接种在启动培养基A₁～A₈上，20d后A₁未有腋芽萌发，A₂～A₈腋芽陆续萌动，但萌发的快慢和启动率有所不同（表4），25d后可见鲜绿嫩芽，且A₆～A₈的腋芽生长状况优于A₂～A₅。其中A₆启动率为70%，腋芽萌发速度最快，且有少量黄绿色、致密的颗粒状愈伤组织产生，A₂中有少量灰褐色愈伤组织产生。从A₅～A₈中可发现，在6-BA和KT的基础上添加2，4-D效果优于添加NAA，且NAA浓度与生长状态呈反比。约35d后将有腋芽萌动的茎段转接到A6培养基中，无丛生芽产生，但产生多片新叶且节间伸长。转接时只将新生芽接到培养基中发现后期嫩芽全部枯萎为棕褐色。故转接时将整个茎段接入培养基中的生长效果要优于只接新生芽。总之，6-BA、KT和2，4-D对茎段腋芽启动、愈伤组织和芽诱导有明显地促进作用。综合启动率和整体生长状况最优培养基是组合A6：MS+6-BA 2.0mg/L+KT2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

3结论及讨论

本研究突破单性木兰种子主要集中于播种育苗方面的试验，以单性木兰种子和茎段分别为外植体进行组织培养研究，以种子为外植体时无萌芽迹象，表明单性木兰种子发芽率低，这和杨成华等进行的试验结果一致，无萌发记录。以单性木兰茎段为外植体时较易污染，75%乙醇50s+0.1%HgCl₂18min消毒效果最佳，污染率为9%。由于消毒剂的种类、浓度、处理时间以及取材的时间、部位等不同对外植体的消毒效果不同，故外植体的消毒处理在组织培养中是至关重要的。

木兰科植物组织培养在不定芽和愈伤组织的诱导上有较大难度。本研究利用单性木兰幼嫩茎段作外植体，有效地诱导了腋芽生长，试验中6-BA、KT和2，4-D的联合使用在单性木兰腋芽的诱导中起积极作用，但6-BA浓度过高会影响芽的生长，出现畸形M。本试验中培养基MS+6-BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+2，4-D0.5mg/L既能促进腋芽的萌动，也能诱导少量愈伤组织，再次转接到该培养基后，单性木兰茎段诱导的腋芽并未进入稳定的增殖阶段，且没有可用于生根的有效芽，说明该培养基对单性木兰茎段腋芽的启动有明显的促进作用，但对于后期的增殖培养基还需进一步的试验探索。endprint