山葵愈伤组织诱导与增殖研究

王跃华　段茂华　任三军　等

摘要：为了获得山葵愈伤组织诱导和增殖的最佳培养条件，选择山葵真叶片、真叶柄和胚轴为外植体，以MS为基本培养基，配以不同浓度的2，4-D和6-BA植物激素进行愈伤组织诱导，并将诱导的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养。结果表明：诱导山葵愈伤组织的最佳培养基配方为MS+4 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，培养25 d后真叶片、真叶柄、胚轴的愈伤组织诱导率分别为（100.0±0.00）%、（60.5±3.29）%、（62.5±3.74 ）%；山葵胚轴外植体产生的愈伤组织增殖倍数最高，培养35 d后的愈伤组织增殖倍数可达（2.48±0.93）倍。

关键词：山葵；愈伤组织；配方；外植体；诱导率；增殖倍数

中图分类号： S567.23+9.043文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0053-02

收稿日期：2014-03-04

基金项目：四川省广元市科技支撑计划（编号：2013-25）。

作者简介：王跃华（1963—），女，山东青岛人，硕士，教授，主要从事药用植物栽培与生药学研究。E-mail：1961689636 @qq.com。山葵（Wasabia japonica）别称山嵛菜，为十字花科山嵛菜属多年生草本半阴生植物，原产中国和日本，被誉为“绿色黄金”[1-2]。山葵具有强烈的辛辣味及特殊的芳香，不仅具有很强的杀菌和助消化功能[3]，而且能促进淀粉性食物的消化，稳定胃肠中的维生素C和消灭消化道中的寄生虫，具有很好的防病治病作用[4-5]。目前山葵多采用分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖存在品种退化、繁殖系数低和种苗带菌等问题，极易导致病害大面积发生[6]。种子繁殖具有速度快、 数量多和能部分减少病害发生的特点，但是由于山葵种子属顽拗性种子，失水过多极易导致种子活力丧失，因此常采用低温高湿保存；同时，山葵种子存在休眠，需有效破除休眠才能促使种子尽快萌发[7-9]。本研究采用植物组培快繁技术，通过筛选培养基配方和外植体种类，以获得山葵愈伤组织诱导的最佳条件，为山葵后续的生物学研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

山葵种子采自四川省广元市；试验材料山葵植物的真叶片、真叶柄、胚轴外植体均取自山葵种子萌发所得的幼苗。

1.2试验方法

1.2.1外植体消毒和培养选取山葵种子萌发25 d的幼苗，取其真叶片、真叶柄和胚轴外植体，将其放在超净工作台上用浓度为0.1 g/L的氯化汞消毒处理3 min后，用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干材料表面的水分，将其接入愈伤组织诱导培养基中。

1.2.2培养基和培养条件愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，激素6-BA 的浓度均为0.5 mg/L，2，4-D 的浓度设定为0、2、4、6、8 mg/L，分别记作A1、A2、A3、A4、A5处理；在20 ℃、12 h/d的光照时长、2 000 lx的光照强度条件下培养25 d后统计各外植体的愈伤组织诱导率。

1.2.3不同外植体诱导的愈伤组织增殖选取由山葵真叶片、真叶柄、胚轴外植体诱导产生的愈伤组织，接种于MS+2 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA培养基中，分别记作B1、B2、B3处理，在20 ℃、10 h/d光照时长、1 800 lx的光照强度条件下增殖培养35 d后统计其愈伤组织的增殖倍数。

1.3数据统计及计算公式

上述试验均重复3次，数据用SPSS 13.0 统计学软件进行方差分析，并采用新复极差（Duncans）法进行多重比较，P<0.05 为显著性差异，P<0.01为极显著性差异，数据统计结果以“x±s”表示。愈伤组织的诱导率、增殖倍数的计算公式如下：愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）×100%；愈伤组织的增殖倍数 = 收获时质量/接种时质量。

2结果与分析

2.1山葵不同部位外植体的愈伤组织诱导

由表1可知，随着2，4-D浓度增高，山葵真叶片、真叶柄、胚轴的愈伤组织诱导率均呈现先提高后降低的趋势；其中未添加2，4-D激素的A1处理，即培养基配方为MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，均不适宜山葵各外植体的愈伤组织诱导，3 种外植体的愈伤组织诱导率均为最低，真叶片的愈伤组织诱导率为（37.5±2.73）%，真叶柄为（0.0±000）%，胚轴为（0.0±0.00）%。由此说明，在培养基中添加生长素2，4-D对山葵愈伤组织的诱导非常重要。培养基配方为MS+4 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA的A3处理，最适宜3种外植体的愈伤组织诱导，愈伤组织的诱导率均为最高，真叶片的愈伤组织诱导率为（100±0.00）%，真叶柄为（60.5±3.29）%，胚轴为（62.5±3.74）%。然而，随着2，4-D浓度进一步升高到6 mg/L 以上时，山葵各外植体的愈伤组织诱导率均呈现出下降趋势，以2，4-D浓度升高到8 mg/L 时的各外植体愈伤组织诱导率下降最为显著，其中真叶柄外植体的愈伤组织诱导率降低了35.5百分点，表明针对不同的植物，选择适宜的2，4-D浓度显得尤为重要。表1山葵不同部位外植体的愈伤组织诱导

处理编号激素浓度配比（mg/L）愈伤组织诱导率（%）2，4-D6-BA胚轴真叶片真叶柄A100.50.0±0.0037.5±2.730.0±0.00A220.525.0±2.3487.5±2.1612.5 ±1.78A340.562.5±3.74100.0±0.0060.5±3.29A460.550.2±1.5787.5±1.7537.5 ±2.13A580.537.5±1.6362.5±1.2625.0±1.46

在试验中观察各外植体产生愈伤组织的情况，发现真叶片外植体在接种3 d后叶片开始卷曲，并且真叶片切口处开始变为嫩绿色且增厚，随后在切口和叶脉处都开始产生黄绿色的愈伤组织；试验中无论是将真叶片正接或反接到培养基上，愈伤组织最先在叶片的切口和与培养基接触的一面长出浅绿色颗粒状愈伤组织，而叶片的游离面产生愈伤组织的时间较晚，并且产生的愈伤组织颜色也多为绿色。真叶柄外植体在插入培养基中培养4 d后，其游离端出现膨大，随后膨大明显并胀裂表皮，接着从表皮的内层细胞长出浅黄色愈伤组织；而将真叶柄直接平放在培养基上的处理，其真叶柄是从中间开始产生膨大，最后整个叶柄膨大后也发生胀裂表皮的情况，随后也从表皮里面产生出愈伤组织。胚轴外植体正接和反接的情况一样，均是先从培养基上部的游离端长出黄绿色和浅黄色颗粒状愈伤组织；而直接将胚轴平接于培养基中则是从胚轴两端长出黄绿色愈伤组织，随后整个胚轴愈伤化，长出愈伤组织。