喹吡罗降低C57BL/6J小鼠的预先弱刺激抑制和间隙预刺激抑制

邹 利，阳玉洁，曾 佩，彭小倩，章红妍，王云甫,(.湖北医药学院，十堰市太和医院神经内科，湖北十堰 44000；.武汉大学人民医院神经内科，湖北武汉 40060；.锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地，湖北十堰 44000)

◇研究简报◇

喹吡罗降低C57BL/6J小鼠的预先弱刺激抑制和间隙预刺激抑制

邹 利1，阳玉洁2，曾 佩3，彭小倩1，章红妍1，王云甫1,3
(1.湖北医药学院，十堰市太和医院神经内科，湖北十堰 442000；2.武汉大学人民医院神经内科，湖北武汉 430060；3.锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地，湖北十堰 442000)

目的探讨C57BL/6J小鼠在急性给予喹吡罗(quinpirole, QNP)前后听觉惊跳反射(acoustic startle reflex, ASR)、预先弱刺激抑制(prepulse inhibition, PPI)和空白预先刺激抑制(gap prepulse inhibition, Gap-PPI)的变化情况。方法20只C57BL小鼠，随机分为实验组(n=10)和阴性对照组(n=10)。实验组给予盐酸QNP腹腔注射，阴性对照组给予等体积生理盐水处理。实验对象均完成惊跳反射的测试。记录注射前的数据为基础值，注射后10 min、24 h进行相同测试。比较各组惊跳反射强度、预先弱刺激抑制率(%PPI)和空白预先刺激的抑制率(%Gap-PPI)。结果对照组小鼠注射生理盐水前后的惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI未见明显改变(P>0.05)。实验组小鼠注射盐酸QNP 10 min后的惊跳反射强度[(0.030 7±0.002 6)N、%PPI(14.78±6.14)%、%Gap-PPI(17.78±9.74)%]较基础值[(0.097 1±0.004 3)N、(45.24±10.11)%、(41.49±4.33)%]降低(P<0.05)；实验组小鼠在注射QNP 24 h后的惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI与基础值相比无明显变化(P>0.05)。实验组注射QNP 10 min后最大惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI均较对照组明显降低(P<0.05)。结论C57BL/6J小鼠急性注射QNP，抑制了预先弱刺激抑制及空白弱刺激抑制，可造成感觉运动门控功能的短期受损并导致小鼠产生耳鸣，可能机制是急性损伤了C57BL/6J小鼠的边缘系统。

感觉运动门控；惊跳反射；弱刺激抑制；间隙预刺激抑制；喹吡罗；耳鸣；边缘系统

听觉惊跳反射(acoustic startle reflex, ASR)是由突然和强烈声音刺激诱发的一种保护行为，广泛存在于哺乳动物及人类中。虽然该反应可以对威胁刺激做出快速反应，但是若不加抑制和过滤，会干扰正常的行为和认知活动[1-2]。感觉运动门控(sensory gating, SG)是大脑过滤并筛选信息的正常能力，通过人大脑对接纳的信息进行过滤，并对随后出现的惊跳刺激反应做出调节，保护前刺激的早期认知编码[3-4]。若在诱发惊跳反射的刺激之前的一定时间间隔内，给予不引起惊跳发生的弱声音，则会抑制惊跳反射刺激引起的身体反射，该效应被称为惊跳反射的预先弱刺激抑制(prepulse inhibition, PPI)[5]。如果在诱发惊跳反射刺激之前的背景噪音中，加入一个空白间隙，则会抑制随后刺激引起的反射，该效应被称为间隙预刺激抑制(Gap-PPI)[6]。PPI是作为一种检测个体SG功能的方法。根据以往的研究，Gap-PPI用于检测大鼠、小鼠和沙鼠耳鸣模型[7-8]。

喹吡罗(quinpirole, QNP)是多巴胺能D2/D3受体激动剂，可以减少多巴胺神经元的自发放电频率，多巴胺释放减少，起到负性作用[9]。QNP为强迫症动物模型常用诱导药物，能够引起大鼠的强迫行为和刻板行为[10]。目前尚未见QNP对C57BL/6J小鼠的PPI、Gap-PPI的研究。本实验建立QNP诱导的C57BL/6J小鼠，通过惊跳反射系统对其最大惊跳反射强度、预先弱刺激抑制率(%PPI)和间隙预刺激抑制率(%Gap-PPI)的检测，研究QNP对其SG功能和多巴胺路径的影响。

1 材料与方法

1.1实验器材及药物行为学测试选取Kinder公司(Poway, CA, USA)的惊跳反射检测系统。该系统装备一个40 cm×30 cm×35 cm消音测试箱和平台压力感受器，扬声器置于测试箱天花板。小鼠置于铝合金制的网格小笼子中，并同笼子一起放置于压力感受平台。测试箱置于一个静音房间，静音房间内噪音分贝控制在20 dB 以下，通过电脑在另一房间对信号取样。

1.2实验动物20只C57BL/6J野生型雄性小鼠，体质量20 g左右，8周龄。所有小鼠分笼饲养(每笼≤5只)，在12 h光照/12 h黑暗的环境中，温度控制在25 ℃左右，湿度控制在45%左右，食物和水充分供应。实验开始前1周对所有动物进行抓握适应性训练，以减少抓握对动物造成的应激。

1.3实验分组及给药实验用C57BL/6J小鼠随机分成对照组(Saline)和实验组(n=10)，分别腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)或QNP(3 mg/kg)，[(-)-quinpirole hydrochlonide, Research Biochemicals公司]用除菌生理盐水稀释为0.1 mg/mL。考虑到QNP药物吸收速度及血药浓度，在给药后10 min开始检测惊跳反射。

1.4惊跳反射测量应用惊跳反射检测系统装置进行测量，实验在09∶00～12∶00进行。将各组小鼠放到装置的小笼子中，并置于测试箱内适应5～10 min后开始测试。3种检测模式如下描述：①ASR检测：6次×500 ms，在65 dB的背景噪音(backgrouud noise)下，给予1个突然的声音刺激为惊跳反射刺激(startle stimulus)，强度为110 dB，记录时间窗内小鼠的惊跳反射；②PPI的检测：6次×500 ms，同样的背景噪音和惊跳反射刺激声音，但在惊吓反射刺激前100 ms时给予1个较弱的刺激(prepulse, 5 kHz，75 dB，50 ms)，记录时间窗内小鼠的惊跳反射。③Gap-PPI刺激：背景噪音和惊跳反射刺激同前，在惊跳反射刺激前100 ms时，去除背景噪音，给予15 ms的空白间隙(gap)，其他设置参数同前，记录小鼠的惊跳反射。每次刺激程序之间的时间间隔为5～10 s，由系统随机产生(图1A所示)。

分笼做好标记，所有小鼠在注射前均完成3种测试，结果作为基础值(Baseline)。实验组小鼠适应30 min 后，给予QNP(3 mg/kg)腹腔注射，分别在注射后10 min(QNP 10 min)和24 h(QNP 24 h)两个时间点检测小鼠惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI。需注意小鼠测试完成后，用700 mL/L乙醇擦拭笼子，晾干后进行下1只小鼠的检测。取250 ms左右的最大惊跳反射强度计算ASR、%PPI和%Gap-PPI。%PPI的计算方法为：(单纯惊跳反射刺激强度―PPI测试中的惊跳反射强度)/惊跳反射强度×100%。

2 结 果

2.1C57BL/6J小鼠ASR、PPI和Gap-PPI的检测情况惊跳反射系统在检测时间窗内每1 ms记录压力感受器传来的正负矢量信号。在惊跳刺激(startle stimulus)即时开始记录压力信号，正常情况下，小鼠在接受惊跳刺激声音刺激后，身体会迅速做出应激性惊跳运动。正向矢量最大值为惊跳反射最大值，出现在记录时间窗的250 ms左右。在PPI检测中，小鼠在接受惊跳刺激前，可听到1个较弱的声音刺激(prepulse)；惊跳刺激后小鼠惊跳幅度会明显变小，系统记录形状趋势和正向矢量最大值的时间点基本不变(图1B中红色线)。而Gap-PPI检测结果为，小鼠最大惊跳反射幅度会减小，系统记录的形状趋势和时间点基本不变(图1B中的蓝色线)。

图1ASR、PPI和Gap-PPI检测模式图和结果

Fig.1 Ideographs and results of ASR, PPI and Gap-PPI in the test system

A：ASR、PPI和Gap-PPI的模式图；B：系统记录的惊跳反射强度值，黑色线代表ASR检测结果，红色线代表PPI检测结果，蓝色线代表Gap-PPI检测结果。

2.2对照组C57BL/6J小鼠ASR、PPI和Gap-PPI的检测结果对照组(Saline)小鼠在注射前完成ASR、PPI和Gap-PPI检测，记录惊跳反射最大强度、%PPI、%Gap-PPI为基础值(Baseline)。检测完毕30 min 后待小鼠适应，遂给予生理盐水注射，完成相同检测。注射后的最大惊跳反射强度为(0.070 7±0.001 3)N，较注射前的基础值[(0.081 3±0.004 7)N]减小，差异没有统计学意义(P>0.05，图2A)；注射后%PPI、%Gap-PPI分别为(42.73±7.13)%、(48.07±11.16)%，与注射前PPI抑制率的基础值[(39.53±4.02)%]、%Gap-PPI的基础值[(39.86±8.55)%]相比有所减弱，但差异没有统计学意义(P>0.05，图2B、C)。

图2对照组C57BL/6J小鼠的ASR、PPI和Gap-PPI的检测结果

Fig.2 Results of ASR, PPI and Gap-PPI testing in C57BL/6J mice of control group

A：单纯听觉刺激后惊跳反射(ASR)最大强度的比较；B：预先弱刺激惊跳反射抑制率(%PPI)的比较；C：间歇弱刺激抑制率(%Gap-PPI)的比较(P>0.05)。

2.3实验组C57BL/6J小鼠ASR、PPI和Gap-PPI的检测结果实验组小鼠给予QNP(3 mg/kg)腹腔注射后10 min(QNP 10 min)和24 h(QNP 24 h)后小鼠最大惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI与基础值(Baseline)的比较结果显示，注射QNP 10 min后最大惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI均减小(P<0.05)；注射QNP 24 h后最大惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI有所减小但无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.4对照组和实验组小鼠ASR、PPI和Gap-PPI检测结果的比较实验组注射QNP 10 min后最大惊跳反射强度、%PPI和%Gap-PPI均较对照组(Saline)明显降低(P<0.05，图3)。

表1实验组小鼠注射QNP前后ASR、PPI及Gap-PPI的检测结果

Tab.1 Results of ASR, PPI and Gap-PPI before and after QNP injection in C57BL/6J mice of experiment group

与注射前的基础值(Baseline)比较，*P<0.05。

图3对照组和实验组小鼠注射QNP后10minASR、PPI和Gap-PPI检测结果的比较

Fig.3 Comparison of ASR, PPI and Gap-PPI results 10 min after QNP injection between control group and experiment group

A：实验组小鼠注射QNP后10 min(QNP 10 min)的最大惊跳反射幅度小于对照组(Saline)，*P<0.05；B：实验组小鼠注射QNP后10 min 与对照组相比%PPI和%Gap-PPI均明显减小，*P<0.05。

3 讨 论

本研究应用听觉惊跳反射测试系统测定了C57BL/6J小鼠的ASR、%PPI和%Gap-PPI以及QNP对其的影响。本实验给小鼠腹腔注射生理盐水后ASR强度、%PPI和%Gap-PPI较注射前的基础值有所减弱，但是差异无统计学意义，可以认定注射生理盐水对C57BL/6J小鼠的ASR、PPI和Gap-PPI没有影响。

QNP是典型的多巴胺D2/D3受体激动剂，用于构建啮齿类强迫症的动物模型，可减少小鼠的运动能力，并增加刻板行为[11-12]。根据已有的研究[13]，本实验QNP用药剂量选用3 mg/kg；考虑到药物吸收和作用时间，选定在注射后10 min进行测定，结果显示，QNP注射后10 min小鼠的ASR最大惊跳反射幅度明显减小，分析可能的机制是QNP减弱了小鼠的运动能力。PPI现象是基本的保护机制，不需要学习而可以稳定存在，PPI反映了个体大脑对信息刺激滤过的功能，是评价SG功能的主要指标之一[14]。本实验未注射药物之前的基础值和对照组小鼠的%PPI 为50%左右。而注射QNP 10 min后再次检测，C57BL/6J小鼠的%PPI明显降低。说明QNP导致PPI缺失、损伤了小鼠的SG功能。为了证实该损伤是否有持续性作用，在QNP注射后的24 h，再次进行相同检测，发现%PPI的确有所降低，但是差异无统计学意义，提示急性注射QNP对C57BL/6J小鼠的PPI功能抑制是短期的。

Gap-PPI经常被用来检测实验动物是否存在耳鸣，可以反映个体在背景噪音中识别Gap信息的功能[15]。本实验C57BL/6J小鼠注射QNP后10 min的%Gap-PPI与注射前和对照组相比也明显降低。根据Gap-PPI的作用原理[16]，注射QNP后小鼠在检测过程中不能发觉到背景噪音中的空白间隙，遂导致Gap-PPI缺失，可能使小鼠产生了耳鸣的症状。注射后24 h再次检测%Gap-PPI未见明显异常，可以认为急性注射QNP对C57BL/6J小鼠的Gap-PPI功能有短期抑制。

SG是大脑对感觉刺激进行筛选和调节，是大脑对无关刺激控制能力的表现。在一些精神病如精神分裂症患者会出现感觉门控功能受损，表现为PPI功能降低。PPI调节机制主要集中在皮质-纹状体-苍白球-丘脑环路上，多巴胺是参与调节的最重要的神经递质之一[17]。Gap-PPI功能机制受损可能跟耳鸣的产生有关，涉及到听觉脑干结构与多巴胺参与的边缘系统[6]。QNP药物作用就是在多巴胺受体上，并且QNP会导致多巴胺能神经元自发放电频率改变，本实验应用QNP 10 min后，C57BL/6J小鼠的%PPI和%Gap-PPI均明显减小，由此推测可能QNP造成了边缘系统内某个多巴胺能通路受损，从而使PPI和Gap-PPI缺失。而且，本实验在QNP注射24 h后再次检测的结果发现，C57BL/6J小鼠的%PPI和%Gap-PPI并没有明显减弱，考虑单次注射QNP造成的损伤可能是短期的，这可能与药物剂量依赖性和多巴胺神经元突触结构及信号传递功能有关，需要进一步研究来探讨其作用机制。

综上所述，本实验证实了激动C57BL/6J小鼠边缘系统的D2/D3信号，可导致给予QNP的急性期内小鼠的运动能力减少、感觉运动门控能力受损以及耳鸣产生。可能是QNP作用于边缘系统的多巴胺神经通路上。其内在信号通路的调控机制有待进一步研究。与此同时，该研究为惊跳反射测定的行为研究、感觉门控功能及其相关疾病的研究提供了研究基础和技术支持。

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R339.1

B

10.7652/jdyxb201801031

2016-12-11

2017-07-11

国家自然科学基金资助项目(No.81671238)；湖北省公益性科技研究项目(No.2012DCA12006)；湖北省教育厅重点项目(No.D20112102)；湖北医药学院优秀中青年科技创新团队资助计划项目(No.2014CXX01)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81671238), Public Welfare Scientific and Technological Research Project of Hubei Province (No.2012DCA12006), the Major Projects of Education Department of Hubei Province (No.D20112102), and the Outstanding Young and Middle-aged Scientific and Technological Innovation Team Funding Program of Hubei College of Medicine (No.2014CXX01)

王云甫，教授，主任医师. E-mail: wyfymc@163.com

优先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171220.1551.008.html(2017-12-20)

(编辑 国 荣)