黄精多糖与黄酮综合提取工艺优化及硒肥对其含量的影响

滕树锐+廖璐婧+武芸+江念+郑小江

摘要：采用水提醇沉法优化黄精（Polygonatum sibiricum）多糖与黄酮的综合提取工艺，通过调节不同的硒浓度，分析不同外源硒条件下黄精多糖与黄酮的含量。结果表明，黄精多糖与黄酮最佳综合提取工艺为料液比1∶70（g∶mL）、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、微波辅助时间2.5 min，在此工艺条件下，多糖得率186.35 mg/g，黄酮得率为69.54 mg/g。通过调节不同外源硒的浓度，得出25 mg/kg为黄精富集多糖和黄酮的最佳外源硒浓度。

关键词：黄精（Polygonatum sibiricum）；多糖；黄酮；综合提取；硒

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4572-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.039

Abstract： The extraction process of Polygonatum Polysaccharide and Polygonatum flavonoids was optimized by water extraction and alcohol precipitation. The content of polysaccharides and flavonoids in Polygonatum was obtained by adjusting different selenium concentrations. The results showed that Polygonatum polysaccharide and Polygonatum flavonoids of optimal synthesis process is：solid-liquid ratio 1∶70（g∶mL）， extraction temperature 70， extraction time 1.5 h， microwave time 2.5 min， under this condition，the rate of 186.35 mg/g polysaccharides，flavonoids was 69.54 mg/g. By adjusting the concentration of different exogenous selenium，it was concluded that 25 mg/kg was the best exogenous selenium concentration for polysaccharides and flavonoids from Polygonatum.

Key words： Polygonatum sibiricum；polysaccharides；flavonoids；comprehensive extraction；selenium

黃精（Polygonatum sibiricum）为百合科（Liliaeea）黄精属（Polygonatum Mill.）植物[1]。目前，黄精是功能食品、医疗保健方面不可多得的重要原料之一。研究表明，黄精的主要功能成分是黄精多糖，但也有研究表明黄酮也是其有效成分之一，且总含量也十分可观[2，3]。黄精多糖的研究已经较为深入，研究表明其具有抗肿瘤、抗辐射、改善记忆等作用[4]。黄酮类物质一直是天然产物的研究热点，其特有的结构使其具有抗氧化、降血糖、调血脂、调节心血管、预防动脉粥样硬化等作用[5]。硒是人类必需的微量元素，具有增强免疫力、防治糖尿病、防治心血管疾病、抗癌等功效[6-11]。天然含硒的中药材，不仅可以有效补充硒含量，而且使中药具有较高的功能活性，提高中药材的有效成分，使其具有更高的药用价值[12，13]。

有学者对黄精多糖和黄酮单一的提取工艺已经有所研究[14-16]，但是对多糖和黄酮同时提取的工艺鲜见报道，一种快速、方便、安全、稳定的综合提取方法对黄精的深度开发具有极大的推动力。硒作为目前科学领域的研究热点，富硒黄精的研究目前鲜见报道，富硒黄精的研究对黄精产业和富硒中药的发展具有重要意义。本研究采用水提醇沉法优化黄精多糖与黄酮的综合提取工艺，通过调节不同的硒浓度，得出在不同外源硒的条件下黄精多糖与黄酮的含量，以期为富硒黄精的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：黄精由湖北省农业科学院中药材研究所提供，由湖北民族学院郑小江教授鉴定。

试剂：亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、石油醚、正丁醇、苯酚、浓硫酸、香草醛、冰醋酸、硝酸铝均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、FA-1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、DFY-500型摇摆式高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、HHS型数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）、TDL-80-2B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、GXZ-9140型数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 方法

1.3.1 综合提取工艺优化 取黄精地下部分于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛，保存备用。

黄精多糖和黄酮的综合提取工艺流程：粉碎过的样品→脱脂处理→微波辅助→溶剂浸提→高速离心→去残渣取上清液→浓缩→加入高浓度乙醇→低温静置24 h→离心→得到上清液a和沉淀b[17]。上清液a→减压浓缩→冷冻干燥→粗黄酮。沉淀b→加热水溶解→再加高浓度乙醇沉淀→冷冻干燥→粗多糖。

1.3.2 含量测定 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[18]，采用铝盐显色法测定总黄酮含量[17]。

1）多糖标准曲线。精确称取0.4 g葡萄糖标准品，加水溶解后于2 L容量瓶中定容，得到0.2 g/L的葡萄糖标准液。分别取9个100 mL容量瓶，每个容量瓶中放入10～90 mL配制的葡萄糖标准液，加去离子水定容。分别取定容后的溶液1 mL，置于9个25 mL的棕色容量瓶中，9个容量瓶分别加入新制成5%的苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL浓硫酸，充分摇匀。于室温冷却，待温度恢复常温后，在490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线[18]。得线性回归方程为y=9.423x+0.003 1，R2=0.999 7。多糖得率=C1×V1×N1/m1。式中，C1为测得样品溶液中葡萄糖的质量分数（mg/mL）；V1为样品溶液的最终稀释体积（mL）；N1为稀释倍数；m1为样品质量（g）。

2）黄酮标准曲线。精确称取0.2 g芦丁标准品，加乙醇溶解后置于2 L容量瓶中，加水定容，得到0.1 g/L的芦丁标准品溶液。精密吸取上述标准品溶液1～10 mL分别置于25 mL的棕色容量瓶中，加去离子水5 mL后加入1 mL的5%的NaNO2溶液，摇匀后静置5 min，再加1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后静置5 min，再加入4 mL 10%的NaOH溶液，摇匀静置20 min后，在波长为510 nm处测定各个容量瓶的吸光度，通过吸光度与芦丁浓度的关系绘制标准曲线，其中浓度为横坐标，吸光度为纵坐标[17]。得到线性回归方程：y=8.542 1x-0.022 3，R2=0.999 4。黄酮得率=C2×V2×N2/m2，式中，C2为测得样品溶液中黃酮的质量浓度（mg/mL）；V2为样品溶液的最终稀释体积（mL）；N2为稀释倍数；m2为材料质量（g）。

1.3.3 单因素试验

1）料液比。称取材料粉末0.5 g，料液比（g∶mL，下同）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90，固定提取温度为60 ℃、提取1 h，微波功率100 W，微波时间2.0 min，提取3次，取平均值得到最佳料液比。

2）提取温度。称取材料粉末0.5 g，温度梯度为40、50、60、70、80、90、100 ℃，固定料液比为1∶60，提取1 h，微波功率100 W，微波时间2.0 min，试验提取3次，取平均值得到最佳提取温度。

3）提取时间。称取材料粉末0.5 g，提取时间梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，固定料液比为1∶60，温度为60 ℃，微波功率100 W，微波时间2.0 min，试验提取3次，取平均值得到最佳提取时间。

4）微波时间。称取材料粉末0.5 g，微波时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min，固定料液比为1∶60，提取1 h，温度60 ℃，试验提取3次，取平均值得到最佳乙醇浓度。

1.3.4 正交试验设计 选择料液比、提取温度、提取时间、微波时间的不同水平进行正交试验，试验因素和水平见表1。

1.3.5 硒肥处理试验 以珍珠岩和蛭石按1∶1混合为固体基质，添加霍格兰营养液培养一年生黄精，挑选黄精幼苗使其苗高、块茎大小、叶片数等保持一致，不同浓度硒每组为3个重复处理，每个处理为6株。试验硒浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125 mg/kg[19]。浇足营养液，从处理当日开始，待其生长达到100 d后，按“1.3.1”中所优化的方法测定多糖和黄酮含量。

1.4 数据处理

整理计算数据采用Excel 2003软件，处理数据及方差分析使用SPSS 19.0统计软件进行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对黄精多糖和黄酮得率的影响 料液比在1∶20～1∶80，黄精多糖得率呈逐渐增长趋势，当料液比超过1∶80后，多糖得率下降，且在料液比 1∶80和其他处理差异达到显著水平（P<0.05）；料液比在1∶20～1∶70，黄精黄酮得率呈逐渐增长趋势，当料液比超过1∶70后，黄酮得率呈缓慢下降趋势，且料液比1∶50、1∶60、1∶70三个处理差异不显著（P>0.05）；故设置正交试验范围为1∶60、1∶70、1∶80、1∶90。

2.1.2 提取温度对黄精多糖和黄酮得率的影响 提取温度在40～70 ℃，黄精多糖得率呈逐渐增长趋势，当提取温度超过70 ℃后，多糖得率下降，且在提取温度40～70 ℃处理差异达到显著水平（P<0.05）；提取温度在40～80 ℃，黄精黄酮得率呈逐渐增长趋势，当温度超过80 ℃后，黄酮得率呈缓慢下降趋势，且温度70～100 ℃ 4个处理差异不显著（P>0.05），故设置正交试验范围为60、70、80、90 ℃。

2.1.3 提取时间对黄精多糖和黄酮得率的影响 提取时间在0.5～1.5 h，黄精多糖得率呈逐渐增长趋势，当提取时间超过1.5 h后，多糖得率变化不明显，且1.5～3.0 h时间黄精多糖得率差异不显著（P>0.05）；提取时间在0.5～1.5 h，黄精黄酮得率呈逐渐增长趋势，当提取时间超过1.5 h后黄酮得率逐渐下降，且1.5 h处和其他时间点黄精黄酮得率差异达到显著水平（P<0.05）；故设置正交试验范围为1.0、1.5、2.0、2.5 h。

2.1.4 微波时间对黄精多糖和黄酮得率的影响 微波辅助时间在0.5～3.0 min，黄精多糖得率呈逐渐增长趋势，当微波时间超过3.0 min后，多糖得率急剧下降，且2.5、3.0 min和其他时间点多糖得率差异达到显著水平（P<0.05）；提取时间在0.5～2.0 min，黄精黄酮得率呈现逐渐增长趋势，当提取时间超过2.0 min后黄酮得率逐渐下降，且2.0～3.0 min各时间点黄酮得率差异不显著（P>0.05）；故设置正交试验范围为1.5、2.0、2.5、3.0 min。

2.2 正交试验结果

表2为黄精多糖和黄酮综合提取工艺正交试验结果，根据表2中的结果采用SPSS 19.0软件进行方法分析，得到表3和表4。

由表3可知，料液比对黄精多糖和黄酮得率的影响均不显著（P>0.05）。由表4可得，多糖得率料液比大小为A3>A2>A4>A1，黄酮得率料液比大小为A1>A2>A4>A3，综合得出，最佳料液比为A2，即1∶70。

由表3可知，提取温度对黄精多糖和黄酮得率均有显著影响（P<0.05）。由表4可得，多糖得率提取温度大小为B2>B3>B1>B4，黄酮得率料液比大小为B1>B2>B4>B3，从节能方面综合考虑，选择最佳提取温度为B2，即70 ℃。

由表3可知，提取时间对黄精多糖有显著影响（P<0.05），对黄精黄酮得率影响不显著（P>0.05）。微波辅助时间对黄精多糖有显著影响（P<0.05），对黄精黄酮得率影响不显著（P>0.05）。由表4可得，多糖得率提取温度大小为C2>C3>C4>C1，选择最佳提取时间为C2，即1.5 h。多糖得率微波时间大小为D3>D4>D2>D1，最佳提取时间为D3，即2.50 min。

2.3 验证试验

准确称取材料5 g，进行3组平行试验，在A2B2C2D3料液比1∶70、提取温度70 ℃、提取时间 1.5 h、微波辅助时间2.5 min，所得结果为多糖得率186.35 mg/g，黄酮得率为69.54 mg/g。优化出的工艺所得多糖得率高于正交项中任意一项，黄酮得率较A1B3C3D3和A3B3C1D2略低，综合分析得出，该工艺稳定，能较全面地同时提取黄精中的黄酮和多糖。

2.4 不同浓度硒对黄精多糖和黄酮含量的影响

如图5所示，在施加硒后，黄精多糖含量呈先降低后增加再降低的趋势。硒浓度在5～15 mg/kg时，硒对黄精多糖含量表现为抑制作用；当硒浓度在20～40 mg/kg时，硒对黄精多糖含量表现为促进作用，且在硒浓度为30 mg/kg时促进作用最为显著；其后黄精多糖含量随着硒浓度的增加又表现为抑制作用，且抑制作用逐渐增强。在施加硒后，黄精黄酮含量呈先增加再降低的趋势，硒浓度在5～25 mg/kg时，硒对黄精黄酮含量的增长表现为促进作用；当硒浓度达到25 mg/kg后，随着硒浓度的增加，黄精黄酮含量表现为抑制作用，且抑制作用逐渐增强。

3 结论与讨论

对料液比、提取温度、提取时间、微波辅助时间4个因素进行单因素和正交试验，得出黄精多糖和黄酮的最佳综合提取工艺为料液比1∶70、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、微波辅助时间2.5 min，在此工艺条件下，多糖得率186.35 mg/g，黄酮得率为69.54 mg/g。通过调节不同外源硒的浓度，得出25 mg/kg为黄精富集多糖和黄酮的最佳外源硒浓度。

本试验在传统提取工艺过程中加入了微波辅助法，得出的工艺稳定，具有一定的高效性，且提取溶剂为水，即成本低廉又不污染环境。提取率黄精多糖的得率和提取温度、提取时间、微波辅助时间关系比较密切，在单一提取黄精多糖的过程中应注意对这3个因素的控制；黄精黄酮的得率和提取温度比较密切，在单一提取过程中应注意对温度的控制。

施加外源硒对黄精有效成分的影响总体表现为低浓度影响不显著，中浓度具有一定的促进作用，高浓度具有很强的抑制作用，这说明不同浓度的硒能在不同水平上影响黄精的次生代谢过程，从而影响有效成分的富集。高浓度条件下表现为显著的抑制作用，可能是硒浓度过高对植物体产生了伤害，影响其正常的生长发育。故在处理富硒中药材和富硒农作物的过程中，不能一味追求植物对硒含量的吸收，对有效成分的富集和植物相应的生长发育也是其重要的考察因素。

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