钩吻总碱对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

李德森 ，廖华军 ，苏志敏 ，陈 亮 ，王文义 ，陈 欣 ，吴水生

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.永春县医院，福建 永春 362600；3.福建中医药大学附属福州中医院，福建 福州 350001）

钩吻总碱对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

李德森1，廖华军1，苏志敏2，陈 亮3，王文义1，陈 欣1，吴水生1

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.永春县医院，福建 永春 362600；3.福建中医药大学附属福州中医院，福建 福州 350001）

目的 研究钩吻总碱对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成的影响。 方法 制备CAM模型，取50个鸡胚随机分为5组：空白对照组、阳性对照组及实验组（钩吻总碱高、中、低剂量组），于CAM上植入混合纤维素酯微孔滤膜药物载体，实验组加入不同浓度的钩吻总碱，空白对照组不加药品，阳性对照组加入PBS溶液，观察各组CAM新生血管生长的情况。 结果 钩吻总碱高、中剂量组及阳性对照组均有抑制CAM新生血管生成作用，而钩吻总碱低剂量组无抑制作用，与空白对照组作用相当。 结论 钩吻总碱具有抑制CAM新生血管生成的作用，并呈量效关系。

鸡胚绒毛尿囊膜；新生血管生成；钩吻总碱

钩吻 Gelsemiumelegans（Gardn.etChamp.）Benth.系马钱科Loganiaceae钩吻属Gelsemium植物，生物碱既是其活性成分，也是毒性成分，具有镇痛、抗炎、散瞳、抗肿瘤、抑制心脏收缩、升压、抑制平滑肌、促进免疫等多种药理功能［1-2］。长期以来，民间将钩吻用于治疗风湿痹痛、湿疹、皮癣、神经痛等症，其具有良好的抗肿瘤、镇静镇痛、散瞳、影响免疫功能等多种药理功能，尤其在延长肝癌患者生存期和肿瘤患者镇痛方面有独特的优势［3］。恶性肿瘤侵袭转移过程中，新生血管形成是必要条件，近年来，抗肿瘤血管生成已成为肿瘤防治的一个重要途径。而钩吻是否能影响血管生成，通过系统性的文献回顾，并未发现钩吻总碱对血管生成的实验研究。鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）技术因具有取材方便、易于观察、操作简单、成本低廉、实验周期短、可重复性高等优点，目前已被广泛应用于血管生成及转移等研究［4］，因此本实验拟研究钩吻总碱对CAM血管生成的抑制情况。

1 实验材料

1.1 试剂与仪器 钩吻总生物碱提取物［5］（以下简称钩吻总碱），由福建中医药大学药学院提供，用二甲基亚砜（DMSO）溶液配制成 500 mg·mL-1的母液，于 4℃保存待用，实验时配制成低剂量（50 μg·mL-1）、中剂量（100 μg·mL-1）、高剂量（200 μg·mL-1）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）、甲醛、丙酮、石蜡、新洁尔灭（福州精锐生物技术有限公司）；YZ-875SA型超净工作台（苏州净化集团公司）；CO-25型恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高压消毒锅（HVE50，上海天呈科技有限公司）；数码相机［D90／18-200，尼康映像仪器销售（中国）有限公司］；混合纤维素酯微孔滤膜（孔径0.22 μm，上海兴亚净化材料厂）。手术相关器械由福建中医药大学医学研究中心提供。

1.2 种蛋 贵妃鸡受精种蛋，重量45～55 g，购自江西省吉安市泰和乌鸡哥生态农场。

2 实验方法

2.1 CAM模型制备 参照文献［6-8］。

2.1.1 鸡胚准备 新鲜种鸡蛋50只，以0.1%新洁尔灭消毒，待种蛋表面干燥后，置于恒温孵育箱，设置温度37.8℃、相对湿度60%的环境中孵化，每日自动翻转2次，第3天检卵灯照蛋，抛弃无血管鸡胚。

2.1.2 开窗 鸡胚发育3 d，选取发育良好的鸡胚，用酒精棉球消毒2遍，在超净工作台无菌条件下于外壳上开10 mm×10 mm大小的开口，暴露绒毛尿囊膜，具体操作如下：① 取鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，并在胎位附近无大血管处画一记号；用碘酒、乙醇消毒气室顶部和记号处，然后在气室顶部钻一小孔，同时用小钢锯在记号处将卵壳磨一个和纵轴平行的裂痕，勿伤及壳膜；将卵平放，轻轻将裂痕处卵壳去掉，勿伤及壳膜；于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上；用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工假气室。② 用无菌透明胶带将假气室封好，继续孵化3 d后将高温消毒后的混合纤维素酯微孔滤膜（孔径 0.22 μm、直径 6 mm）为载体，小心放置于矩形窗口的边缘1／3处，远离已形成的致密血管网。

2.2 分组给药 混合纤维素酯微孔滤膜植入后，将种蛋随机分为空白对照组、阳性对照组（PBS组）及实验组（钩吻总碱高、中、低剂量组）5组，每组10个鸡胚。用微量加样器加样，空白对照组不加任何药品，阳性对照组滴加0.5 mg·mL-1PBS，实验组分别滴加含钩吻总碱 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1药液，各组剂量均为 10 μL。加样后用无菌透明胶带封闭窗口，继续孵化3 d。每12 h观察1次。

2.3 标本采集 加入药物继续孵化3 d后，揭去鸡胚表面无菌透明胶带，以甲醇和丙酮混合液（1∶1）室温固定15 min，以载体为中心剪下CAM约3 cm×3 cm，展铺于滤纸上，晾干。以滤纸为背景，由专人观察裸眼可及的载体周围的血管数并进行比较。在自然光线下，将尼康D90／18-200数码相机固定在三角架上，禁用闪光灯，采用近距离模式拍照，放大2倍，观察载体周围新生血管生成情况。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料属正态分布用（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 鸡胚存活情况 加药后48 h，钩吻总碱高剂量组死亡2个，阳性对照组、钩吻总碱中剂量、低剂量组各死亡1个。死亡鸡胚颜色变浅，胚内呈水样，血管影不清晰，无胚胎活动。存活鸡胚血管呈鲜红色，胚胎活动正常。

3.2 CAM血管形态学比较 空白对照组血管呈分级生长，走形清晰，主血管管径明显较粗；阳性对照组和钩吻总碱高、中剂量组血管数量少，颜色偏浅；钩吻总碱低剂量组血管亦呈分级生长，走形清晰。见图 1。

图1 各组CAM血管形态比较图（×3）

3.3 各组CAM大、中血管生成数比较 见表1。

表1 各组CAM血管生成数比较（x±s） 支

4 讨 论

钩吻生物碱毒性太大［9］，治疗量和中毒量非常接近，安全指数较小。1945 年，Algire［10］提出了“肿瘤血管生成的概念”，即肿瘤的生长具有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段。研究［11］表明：当恶性肿瘤体积大于1 mm3时，主要靠生成肿瘤血管获取养分，故肿瘤生长和转移依赖肿瘤新生血管的形成。因此，抑制新生血管生成，已成为抑瘤抗癌、防止恶性肿瘤复发及转移的可行方法。本实验应用钩吻总碱作用于CAM，实验过程中发现加药后有鸡胚死亡现象，可能跟鸡胚开窗后失去蛋壳和蛋膜保护致胚胎脱水过多有关［12］，亦不能排除钩吻生物碱的毒副作用。在抑制CAM血管生成方面，钩吻总碱低、中、高剂量组给药后血管生成呈递减趋势，说明CAM血管的抑制与钩吻总碱具有量效关系。本实验验证钩吻总碱对CAM具有抑制血管生成作用，由于CAM血管新生为正常生成而肿瘤血管新生为异常生成，钩吻生物碱抗肿瘤作用与肿瘤血管新生是否相关，还有待进一步研究。同时由于体内实验与体外实验的剂量难以直接换算，且体内外药物代谢存在差别，钩吻总碱对于抑制荷瘤动物模型肿瘤血管新生的有效剂量也有待进一步探索。

［1］ 冯时茵，栗建明，侯惠婵，等.钩吻生物碱成分的薄层色谱研究［J］.中药新药与临床药理，2013，24（1）：77-80.

［2］ 苏泽球.钩吻生物碱的分离与测定［J］.刑事技术，1988（1）：5-8.

［3］ 王英豪.毒性中药钩吻配伍玉叶金花减毒机制研究［D］.福州：福建中医药大学，2016.

［4］ 李萍，黄光武，张哲.鸡胚绒毛尿囊膜模型与人类肿瘤研究［J］.广西医科大学学报，2014，31（3）：520-523.

［5］ 陈亮，杨樱，卢伊，等.钩吻总碱对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响［J］.福建中医药大学学报，2013，23（4）：41-43.

［6］ RIBATTID，VACCA A，RONCALI L，et al.The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis［J］.International Journal of Developmental Biology，1996，40（6）：1189-1197.

［7］ 马继伟，张勇，张逸凯，等.改良鸡胚尿囊膜肿瘤实验动物模型及其生物学行为观察［J］.中国比较医学杂志，2013，23（8）：30-33．

［8］ 张树成，吴志奎，王蕾，等.研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜实验模型的应用［J］.中国中医基础医学杂志，1999，5（5）：16-19.

［9］ 易金娥，袁慧.钩吻毒素的研究进展［J］.湖南环境生物职业技术学院学报，2003，9（1）：26-30.

［10］ 郭青龙.肿瘤药理学［M］.北京：化学工业出版社，2008：99-100.

［11］张春丽.中药对肿瘤血管生成抑制作用的研究［J］.北京中医药，2011，30（2）：156-160.

［12］钟晓浩，李延龙，周迅.鸡胚死亡的原因研究进展［J］.家禽科学，2009（7）：46-48.

R285.5

A

1000-338X（2017）06-0030-02

2017-09-20

福州市科技计划项目（2014-S-140-1）

李德森（1982—），男，讲师，医学硕士，主要从事中药学药性理论研究。

吴水生（1965—），男，教授，博士生导师，医学博士。E-mail：498366498@qq.com