鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)的分离与鉴定

张俊平，杨惠萍，蒋凤英，倪建平，张春玲，李春华*

(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106;2.上海佳牧生物制品有限公司，上海201106)

上海市川沙地区发生一种流行性疾病，其来势凶猛，传播速度极快，病乳鸽几乎100%死亡，青年鸽和成年鸽死亡也相当严重，造成极大经济损失[1]。通过对该病进行流行病学调查、临床症状和病理变化观察，初步判定为鸽副黏病毒Ⅰ型感染。为进一步确定感染病原，采集病料进行了病毒的分离鉴定。

1 材料

1.1 病料在上海川沙某发病鸽场无菌采取死亡鸽的脑、肝脏、脾脏、肾脏。

1.2 试验动物 SPF种蛋、SPF雏鸡，均购北京梅里亚-维通实验动物技术有限公司;SPF鸡胚为SPF种蛋自行孵化至所需日龄。30日龄抗体阴性幼龄鸽(HI抗体≤2)，购自上海青浦养鸽场。试验鸡、鸽隔离饲养。

1.3 参考血清 抗鸡新城疫病毒(NDV)阳性血清、减蛋综合征病毒(EDS76V)阳性血清，均购自中国兽医药品监察所;禽流感病毒(AIV)H5、H9、H7阳性血清，购自哈尔滨兽医研究所。

1.4 1%红细胞悬液 取4～5月龄的SPF鸡血液，按常规方法[2]洗涤制备。

2 方法

2.1 病原体分离培养

2.1.1 病料的采集与细菌学检查 菌采取死亡鸽的脑、肝脏、肾脏、脾脏病料进行涂片，革兰氏染色后镜检，观察结果;同时将上述病料分别接种于普通肉汤、普通琼脂和血琼脂培养基中，37℃培养48 h后，观察结果。

2.1.2 病料的处理 将上述病料混合研磨，用生理盐水作1∶5稀释，1500 r/min离心15 min，取上清液除菌过滤、分装，标识为川沙株，-20℃以下保存作为病毒分离用[3]。

2.1.3 细菌培养 将上述处理的病料上清液分别接种于普通肉汤、普通营养琼脂、血琼脂培养基培养，37℃培养96 h，观察细菌生长情况。

2.1.4 病毒的分离 取上述细菌培养阴性的病料上清液尿囊腔接种于10日龄 SPF鸡胚，0.1 mL/胚。置37℃孵箱孵育，弃去24 h死亡鸡胚，以后每6 h观察一次，并随时取出死亡鸡胚，置4℃冰箱中过夜，收集尿囊液并观察鸡胚病变，并盲传5代(E1～E5)，收集死亡鸡胚尿囊液。

2.2 病毒鉴定

2.2.1 血凝(HA)试验 应用β-微量法，对收集的各代尿囊液进行血凝试验，检测有无血凝性及血凝效价。

2.2.2 血凝抑制(HI)试验 分别应用NDV阳性血清、AIV-H5、AIV-H9和AIV-H7阳性血清和EDS76V阳性血清，与分离株尿囊液按β-微量法进行 HI试验[4]。

2.2.3 中和试验 取分离株尿囊液分成2份，分别与NDV阳性血清和正常血清等量混合，室温下作用1 h后，将中和后的尿囊液用灭菌的生理盐水作 10 倍系列稀释，取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-86个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0.1 mL/胚，37℃继续孵育，接种后每24 h照胚一次，24 h前死亡的鸡胚弃去不计，24～120 h死亡的鸡胚随时取出，记录鸡胚死亡情况，计算中和前后尿囊液的ELD50，并对鸡胚尿囊液检测 HA 效价[4]。

2.2.4 动物回归试验 以1 mL的分离毒株E5代尿囊液对10只30日龄抗体阴性幼龄鸽进行肌肉注射、滴鼻和点眼感染，连续记录21 d，逐日观察记录发病和死亡情况以及剖检变化。采存活鸽血清测定抗体水平，并观察能否从病死鸽脾、脑中分离到该病毒。

2.3 RT-PCR鉴定

2.3.1 引物设计 参照文献[5]，针对NDV F基因序列设计合成一对引物，用于扩增F基因，其序列为16s:5’-ATGGGCTCCAAACCTTCTACC-3’;P16a:5’-GCATTCATGCTCTTGTAGTGGCTCT-3’。引物由上海博亚生物工程有限公司合成。

2.3.2 病毒RNA的提取 取病毒尿囊液和正常SPF鸡胚尿囊液各200 μL，参照BIOMIGA公司的EZgeneTMVirus RNA Kit说明书提取RNA，-20℃保存备用。

2.3.3 RT-PCR 以上述提取的总RNA为模板，用随机引物进行反转录，合成cDNA第一链，采用20 μL 反应体系:总 RNA 8.0 μL，随机引物(20 pmol/μL)1.0 μL，70 ℃变性10 min，然后在冰上加入5×RT Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2.0 μL，M-MLV 反转录酶(200 U/μL)1.0 μL，Ribonuclease Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，补加灭菌超纯水至20 μL。将上述所有成分轻弹混匀，短暂离心，42℃反应60 min后95℃ 5 min灭活反转录酶。反转录产物立即进行PCR或-20℃保存备用。

以反转录产物为模板，采用50 μL体系进行PCR，各反应成分如下:cDNA 模板5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，P16s、P16a 引物(20 pmol/μL)各1.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.5 μL，补加超纯水至50 μL。反应条件为:94℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2.5 min，35个循环，72℃延伸10 min。阴性对照为正常SPF鸡胚尿囊液，在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。

2.4 理化特性鉴定

2.4.1 氯仿敏感性试验 E5代尿囊液经3000 r/min离心20 min，弃沉淀。将氯仿以5%的量加入上清液中，充分摇匀后，置于4℃振荡10 min。再经500 r/min离心5 min，吸上层液接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2 mL/胚，37℃孵育5 d。收取不同时间死亡鸡胚的尿囊液并作血凝试验。同时设立未处理病毒作为对照组。氯仿处理组病毒的滴度比对照组下降2个数量级以上者，判为对氯仿敏感。

2.4.2 乙醚敏感性试验 将无水乙醚和E5代尿囊液以1∶4的比例混合，振荡数分钟，2000 r/min离心20 min。取下层病毒液，接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2 mL/胚。37℃孵育5 d，收取不同时间死亡鸡胚的尿囊液并作血凝试验。同时设立未处理病毒作为对照组。如系乙醚敏感病毒，则病毒效价明显降低。

2.4.3 耐酸性试验 用0.1 mol/L HCl将E5代尿囊液pH值分别调至3.0、5.0，置37℃作用2 h，用5.6%NaHCO3，将尿囊液pH调至7.2左右，然后接种5枚SPF鸡胚，0.1 mL/胚。37℃孵育5 d，收取不同时间死亡鸡胚的尿囊液并作血凝试验。同时设立未处理病毒作为对照组。如果试验组的病毒效价比对照组降低两个数量级以上乃至完全灭活者，则表明该病毒对酸敏感;相差不到1个对数者为对酸有耐受性。

2.5 致病指数测定

2.5.1 鸡胚半数致死量(ELD50)的测定 将分离毒E1～E5代尿囊液10倍系列稀释，选择10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-96 个稀释度，每个稀释度尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1 mL/胚，37℃继续孵育，记录24～120 h鸡胚死亡情况，测定其ELD50。

2.5.2 最小致死量病毒致死鸡胚平均死亡时间(MDT)的测定 按常规方法[2]进行，应用10日龄SPF鸡胚对分离毒E5代尿囊液进行MDT的测定。

2.5.3 1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)的测定

取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释的新鲜E5代病毒液0.05 mL/只，另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05 mL/只。接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。

观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0分，发病为1分，死亡为2分)累计总分数。最后将所累计总分除以被观察的累计总数，计算ICPI。

2.5.4 6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI)的测定

取6周龄SPF鸡10只，静脉接种10-1稀释的E5代尿囊液0.1 mL，另取2只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病(鸡只蜷缩在一起不愿运动，不愿采食或饮水，但无明显的翅、腿麻痹表现)、麻痹(翅、腿明显不协调，翅膀下垂)和死亡。

观察10日后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值(正常为0，发病为1，麻痹为2，死亡为3)累计总分数。以累计总分除以正常、发病、麻痹和死亡动物的累计总数计算IVPI。

IVPI=(10日内累计死亡数×3+10日内累计瘫痪数×2+10日内累计发病数×1)÷10日内累计观察数。

3 结果

3.1 病原体分离培养 病料经细菌学检查，结果为阴性。病料上清液所接种的细菌培养基经37℃培养96 h，均无细菌生长。病料上清液经尿囊腔接种SPF鸡胚盲传5代，盲传至第4代鸡胚死亡时间出现规律性死亡，并且可见死亡鸡胚全身出血、尿囊膜上也有较多的出血点。

3.2 病毒鉴定

3.2.1 HA和HI试验 以上所有死亡鸡胚尿囊液均有血凝性，其中，E1～E3代尿囊液HA效价偏低，在1∶2～1∶8;E4～E5代尿囊液 HA效价均在1∶64～1∶256;HI试验表明，分离毒的血凝性能够被NDV阳性血清所抑制，但不能被 AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7阳性血清、EDS76V阳性血清所抑制。

3.2.2 中和试验 将分离毒E4、E5代尿囊液分别与NDV阳性血清和正常血清中和，试验结果表明:尿囊液能被NDV阳性血清中和下降3～4个滴度。试验结果见表1。

表1 E4～E5代尿囊液中和试验结果 lgELD50/0．1 mL

3.2.3 动物回归试验 试验鸽接种病毒液后3日开始发病，直至接毒后第5日全部发病，并且死亡6只，发病鸽表现出精神不振，食欲减退等，拉黄绿色稀便;第8日全部死亡，死亡鸽剖检均见不同程度的腺胃、肠道出血和盲肠扁桃体出血、肿大。人工接种鸽症状和病变与自然发病鸽一致，从剖检病死鸽体内分离回收到相同毒株。

3.3 RT-PCR扩增 从PPMV(川沙株)分离株扩增到1666 bp的特异性片段，大小与预期结果相符(图1)，作为阴性对照的正常SPF鸡胚尿囊液未出现扩增片段。

3.4 病毒理化特性的鉴定 经氯仿处理尿囊液血凝效价和对照组相差2个数量级以上，因而判定分离株对氯仿敏感。经乙醚处理尿囊液接种鸡胚全部健活，尿囊液HA阴性，表明分离株对乙醚敏感。尿囊液经盐酸处理后，血凝效价明显下降，因此判定分离这株对酸敏感。

图1 PPMV川沙分离株的RT-PCR扩增结果

3.5 致病指数测定结果 从发病鸽场采集病料分离物可在鸡胚上增殖良好，培养物E1～E3代的病毒含量较低，从 E4代开始病毒含量≥107.0ELD50/0.1 mL。E1～E5代尿囊液病毒含量分别为104.3、105.5、106.3、107.3、107.5ELD50/0.1 mL。对分离毒E5代尿囊液进行测定，MLD为10-6，MDT为55.2 h，ICPI=144/80=1.8，IVPI=239/100=2.39(表2-表4)。

表2 E5代尿囊液MDT测定结果

表3 E5代尿囊液ICPI测定结果

表4 E5代尿囊液IVPI测定结果

4 结论

试验结果表明，从死亡鸽体内分离到的病毒在鸡胚上生长良好，能凝集鸡红细胞，且这种凝集性可被特异的NDV阳性血清所抑制，结合动物回归试验、RT-PCR鉴定、病毒理化特性测定结果及其临床症状和剖检变化，可确定该分离毒株为鸽副黏病毒Ⅰ型。同时，对其MDT(55.2 h)、ICPI(1.8)、IVPI(2.39)等致病指数的测定结果表明该毒株属于强毒力鸽副黏病毒Ⅰ型，并将该毒株命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)。

动物回归试验表明，通过给抗体阴性鸽注射病毒液可以复制出该病，证明分离的鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)为引起该鸽场发病的病原。

[1]殷 震，刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社，1997.

[2]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版[Z].

[3]符子华，张 波，易 忠，等.鸽新城疫病原的分离与鉴定[J].新疆农业科学，2004，41(增刊):32-34.

[4]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二ΟΟ五年版三部[S].

[5]李春华，杨惠萍，谢 巧，等.鸽副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析[J].江西农业学报，2010，22(6):130-133.