雌激素通过调节COX-2介导的血管生成减弱DMH的诱癌作用*

杨 佳， 王 辉， 张 涛， 史建国， 周 豪， 沈黎明， 曹英豪， 蔡开琳△

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胃肠痔瘘外科，武汉 430070 2华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科，武汉 430022

雌激素通过调节COX-2介导的血管生成减弱DMH的诱癌作用*

杨 佳1， 王 辉1， 张 涛1， 史建国1， 周 豪1， 沈黎明2， 曹英豪2， 蔡开琳2△

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胃肠痔瘘外科，武汉 4300702华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科，武汉 430022

目的探究雌激素抑制结肠肿瘤发生、发展的机制。方法二甲肼(DMH，20 mg/kg，每周1次，共16周)注射诱导卵巢切除术(OVX)处理的SD大鼠，建立结肠肿瘤动物模型，同时设DMH联合雌激素处理组(雌二醇50 μg/kg，每周1次，共16周)及对照组。免疫组化法检测结肠肿瘤微血管密度(MVD)及Ki-67阳性细胞百分比，评估雌激素对肿瘤微血管生成及细胞增殖的影响，Real-time PCR及Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)和环氧合酶(COX-2)在肿瘤组织中的表达情况。结果与DMH组相比，雌激素能够减少平均负瘤率(5.75个/只vs.3.25个/只，P<0.05)；降低结肠肿瘤微血管密度[(28.0±1.9)根/视野vs.(14.0±2.8)根/视野，P<0.05]；降低细胞增殖能力[Ki-67阳性细胞百分比(51.3±6.5)%vs.(31.1±9.7)%，P<0.05]；下调COX-2及VEGF表达水平(均P<0.05)。结论雌激素能够降低DMH诱导的SD大鼠结肠肿瘤的发生发展，其机制可能为通过调节COX-2及VEGF表达从而抑制肿瘤微血管生成。

雌激素； 结肠癌； 环氧合酶-2； 血管内皮生长因子； 血管生成

大量研究显示性激素对结肠癌的发生有影响作用。流行病学研究显示绝经后妇女患结肠癌的概率明显上升，而使用雌激素替代疗法(HRT)后，结肠肿瘤的发生率明显降低[1-3]。

肿瘤内部血管的形成对肿瘤的生长至关重要，其可为肿瘤组织提供新陈代谢所必须的氧气及各种营养成分，也是肿瘤细胞发生远处转移的途径之一。无血管期的肿瘤大小局限在2 mm以内，一旦血管形成，肿瘤就会迅速生长，发生浸润、转移等。

成人器官组织，除了女性生殖系统，正常情况下不存在血管生成，反映了雌激素对血管生成的潜在作用。雌二醇可通过雌激素受体介导子宫的血管生成，而雌激素受体基因敲除或者雌激素受体阻断剂则能抑制血管生成[4]。雌激素及其受体介导的血管生成在乳腺肿瘤的侵袭中也发挥了重要作用[5-6]。

本课题组在前期研究中已证实雌激素能够通过调节缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达进而影响血管生成来减弱二甲肼(dimethylhydrazine，DMH)的诱癌作用[7]，本研究拟证实雌激素能否通过调节炎症因子COX-2及VEGF的表达影响血管生成来减弱DMH的诱癌作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雌性大鼠，购于华中科技大学实验动物中心，24只，体重(200±20)g。清洁级饲养，12 h昼夜交替，动物房温度(22±2)℃，相对湿度(50±10)%，自由饮食水。

1.2 卵巢切除及分组

水合氯醛麻醉，取腰背部中线纵向切口约1 cm，找到卵巢并丝线结扎末端输卵管，切除卵巢，连续阴道涂片4 d，确定无性周期存在。将SD大鼠随机分为3组：DMH组、DMH联合雌激素E2组、对照组，每组8只。药物购自美国Sigma公司，给药剂量DMH为20 mg/kg，E2为50 μg/kg，每周1次，皮下注射，2种药物间隔1 d给药[8]。16周后停止给药，继续喂养6周以达到最优诱癌效果。所有大鼠禁食水1 d后过量水合氯醛处死，取出整段结肠沿纵轴切开，在冰生理盐水中漂洗掉粪便，分别计数肿瘤数量，计算平均负瘤率(每只大鼠平均肿瘤数量)及肿瘤发生率(即出现肿瘤的大鼠数占该组大鼠总数的比例)，用游标卡尺测量诱发的每颗肿瘤长径、宽径及厚径并计算其体积。

1.3 免疫组化检测

取结肠肿瘤组织进行切片，免疫组化检测CD34以评估微血管密度(MVD)，检测Ki-67评估细胞增殖。CD34、Ki-67抗体购自BOSTER公司。石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2 h，脱蜡至水，切片微波修复，3%过氧化氢溶液孵育以阻断内源性过氧化物酶，BSA封闭，加入一抗覆盖组织，4℃过夜，再加入相应种属的二抗，4℃孵育。加入DAB显色液，显微镜下控制显色。

运用Weidner等[9]的方法对结肠肿瘤MVD进行评估。首先于显微镜低倍镜下选择4个血管密度较为密集的区域作为检测区域(hot spots)，然后在高倍镜视野(×400)对微血管进行计数，只要是被染成棕色的内皮细胞或内皮细胞丛，与周围组织境界清楚，均可视为1根微血管，红细胞或管腔结构不作为纳入的必须条件。

1.4 Real-time PCR检测

肿瘤组织加入Trizol(Invitrogen公司)，匀浆离心，氯仿充分乳化，加入等体积异丙醇，充分混匀后，加入75%乙醇并离心，加入适量RNA Free水溶解沉淀，完全溶解后-80℃保存。采用TaKaRa公司逆转录及扩增试剂盒，操作按说明书进行。引物序列为：VEGF上游5′-CAGCTATTGCCGTCCA-ATGA-3′，下游5′-CCAGGGCTTCATCATTGCA-3′；COX-2上游5′-CATTCTTTGCCCAGCACTT-3′，下游5′-TCTCCACCGATGACCTGAT-3′；β-actin(内参)上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，下游5′-TAGGAGCCAGG-GCAGTAAT-CT-3′。采用2-ΔΔCt法计算mRNA表达，以其与内参基因的比值反映目的基因的相对表达量。

1.5 Western blot检测

组织裂解提取总蛋白，超声处理，蛋白浓度测定，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，分别加入相应的一抗孵育过夜，加入相应的稀释二抗孵育1 h，化学发光检测，扫描胶片，用凝胶图像处理系统分析目标条带的吸光度值，以目的基因与内参的积分吸光度比值作为蛋白表达水平。COX-2及VEGF抗体购自Abcam公司。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 雌激素对DMH诱导的肿瘤发生的影响

DMH组、DMH+E2组结肠肿瘤发生率分别为87.5%(7/8)、62.5%(5/8)，差异无统计学意义，但平均负瘤率分别为5.75个/只及3.25个/只，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，DMH组肿瘤平均体积为(87.42±56.23)mm3明显大于DMH+E2组的(38.63±25.57)mm3，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 雌激素对DMH诱导的肿瘤细胞增殖能力的影响

Ki-67在细胞核中表达，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标志，以Ki-67染色阳性细胞百分比评估各组结肠肿瘤细胞增殖情况。免疫组化检测结果显示：DMH组Ki-67阳性细胞百分比平均为(51.3±6.5)%，DMH+E2组Ki-67阳性细胞百分比降低到(31.1±9.7)%，差异有统计学意义(P<0.05)，说明经雌激素处理后细胞增殖显著降低。对照组细胞增殖处于极低水平。见图2。

A：DMH组；B：DMH+E2组；C：对照组图1 各组大鼠DMH诱导的结肠肿瘤标本Fig.1 The specimens of DMH-induced colon tumors in each group

2.3 雌激素对微血管密度的影响

DMH组MVD平均为(28.0±1.9)根/视野，而DMH+E2组减少到(14.0±2.8)根/视野(P<0.05)，对照组微血管密度远低于2个实验组(图3)。

2.4 雌激素对VEGF以及COX表达的影响

DMH组VEGF及COX-2表达水平明显上调，其mRNA相对表达水平分别约为DMH+E2组的2及3倍，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。VEGF及COX-2蛋白表达水平亦呈相同趋势，见图4。

A：DMH组；B：DMH+E2组；C：对照组；D：各组Ki-67阳性细胞百分比；与对照组比较，*P<0.05；与DMH组比较，#P<0.05图2 各组DMH诱导的结肠肿瘤组织中Ki-67阳性细胞百分比(×200)Fig.2 Ki-67 positive cell percentage in DMH-induced tumors in each group (×200)

A：DMH组；B：DMH+E2组；C：对照组；D：各组微血管密度值；与对照组比较，*P<0.05；与DMH组比较，#P<0.05图3 各组DMH诱导的结肠肿瘤组织中的微血管密度(×400)Fig.3 MVD of DMH-induced tumors in each group(×400)

A：VEGF mRNA表达；B：COX-2 mRNA表达；C、D：VEGF及COX-2蛋白表达水平；与对照组比较，*P<0.05；与DMH组比较，#P<0.05图4 各组VEGF及COX-2蛋白的表达水平Fig.4 The expression of COX-2 and VEGF at both mRNA and protein levelsin each group

3 讨论

炎症是身体对外界或内部刺激的应激反应，若炎症短时间存在，其过程可以产生治疗效果，若炎症持续存在时，则可能会导致疾病，如心血管疾病、风湿性关节炎、自身免疫性疾病以及肿瘤等[10-11]。慢性炎症可对DNA以及蛋白进行修改，使细胞组织重塑，改变氧化应激的某些过程及最终结果，而这些都会增加罹患肿瘤的风险[12]。

环氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转变为前列腺素代谢过程中的一个重要的限速酶，包含COX-1和COX-2两个异构体。COX-1为管家基因，表达于多数哺乳动物的组织中，COX-2在正常组织中不表达或微表达，当出现炎症或肿瘤等情况下，表达量可迅速增加[13-14]。大量研究证实COX-2能够促进肿瘤的发生、发展，涉及到的相关机制有：促进细胞生长；抑制细胞凋亡；刺激肿瘤血管生成；促进肿瘤侵袭及转移；抑制局部免疫功能[14-19]。

COX-2是一种氢过氧化物酶，许多促癌物质如烟草、环境及食物因素都可以诱导COX-2合成并使这些底物转变成致癌物损伤DNA及其他大分子物质[20]。DMH诱导大鼠结肠肿瘤动物模型是一种广泛使用的有效模型，用来模拟环境、饮食以及化学物质诱导的人体结肠癌，该模型也很好地模拟了炎症刺激导致COX-2表达上升这一生物过程[21-22]。COX-2在许多肿瘤组织中均过表达，与预后不良密切相关[10]。在结肠肿瘤组织中，VEGF及COX-2的表达存在正相关[23-25]，VEGF是COX-2的重要调控靶蛋白之一，COX-2表达水平变化使前列腺素水平(PGE2、PGF2a、PGD2、PGI2，主要为PGE2[26])发生变化，从而对VEGF表达水平产生影响，而VEGF能够正反馈调节COX-2的表达，使肿瘤血管生成这一过程得以强化[27]。COX-2催化花生四烯酸转变为前列腺素后，后者通过一系列G蛋白耦合跨膜受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)发挥生物作用，包括EP1、EP2、EP3以及EP4等4种亚型受体，EP1及EP3参与抑制细胞内cAMP合成及增强磷酸肌醇水解作用，EP2及EP4均促进细胞内cAMP合成，EP4主要参与PGE2的短期快速生物过程，故前列腺素促进血管生成主要通过EP2受体实现[28-29]，当EP2受体敲除后，结肠肿瘤动物模型中的肿瘤体积明显缩小[30]，肿瘤血管生成过程明显减弱[31]，其中涉及到的信号通路有EP2-cAMP-PKA-GSK-3[32]。

本研究中，DMH能够诱导结肠肿瘤形成，而雌激素处理后，结肠肿瘤虽然在肿瘤发生率上无明显差异，但平均负瘤率及肿瘤体积均显著减小。Ki-67检测显示雌激素能够显著降低肿瘤细胞的增殖能力，进一步检测发现，雌激素处理组微血管密度明显低于DMH组，说明雌激素能够通过影响肿瘤血管生成减弱肿瘤的形成及增殖能力。在探索雌激素发挥这一生物学作用所涉及到的靶点时，我们发现雌激素能够在转录和翻译水平对COX-2表达进行调控，并进而影响重要的血管生成因子VEGF的表达，从而对血管生成进行调控，最终对肿瘤产生影响。

雌激素主要通过其受体ERα及ERβ发挥作用。我们之前的研究证实，结肠组织中主要表达的雌激素受体为ERβ[33]，相关文献也证实雌激素能够通过结合组织特异性受体ERβ而减轻慢性炎症反应[34]，因此推测雌激素可能通过与其受体ERβ结合而实现上述生物学过程。

综上，雌激素可能通过ERβ对COX-2表达进行调节，从而影响前列腺素PGE2的水平，后者通过其受体EP2影响VEGF的表达，进而对肿瘤血管生成进行调控，最终对DMH诱导的结肠肿瘤形成及发展产生影响。

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EstrogenInhibitsDMH-inducedTumorFormationbyRegulatingCOX-2MediatedAngiogenesis

Yang Jia，Wang Hui，Zhang Taoetal

DepartmentofGastrointestinalSurgery，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430070，China

ObjectiveTo explore the underlying mechanism by which estrogen protects against colon cancer.MethodsDMH(20 mg/kg，once a week，for 16 weeks)induced colon carcinogenesis model on ovariectomized SD rats.Estradial combined with DMH group was treated with estradiol 50 μg/kg，once a week，for 16 weeks.Immunohistochemistry was used to detect micro-vessel formation and Ki-67 positive cell percentage，and then VEGF and COX-2 expression was examined by RT-PCR assay and Western blotting.ResultsEstrogen reduced the tumor number and cell proliferation of DMH induced colon tumors[from 5.75 to 3.25，Ki-67 positive cell percentage from(51.3±6.5)% to (31.1±9.7)%，bothP<0.05].The blood vessel densities in polyps decreased in estrogen group，from (28.0±1.9) to (14.0±2.8)，and COX-2 and VEGF expression in mRNA and protein levels also decreased(bothP<0.05).ConclusionEstrogen replacement was a protective factor for ovariectomized rat to DMH induced carcinogenesis and the possible mechanism was inhibition on blood vessel formation by down-regulating VEGF and COX-2 expression.

estrogen； colon cancer； COX-2； VEGF； angiogenesis

*国家自然科学基金资助项目(No.81272655)

杨 佳，男，1986年生，医学硕士，住院医师，E-mail：yangjia3319@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：caikailin@gmail.com

R735.35

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.006

(2017-08-10 收稿)