长链非编码RNA在骨肉瘤中的研究进展

吴发帅， 高 枫， 浦飞飞， 邵增务

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022

长链非编码RNA在骨肉瘤中的研究进展

吴发帅， 高 枫， 浦飞飞， 邵增务△

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022

长链非编码RNA； 骨肉瘤； 分子标志物

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，年发病率为(1～4)/100万，男女发病率之比为1.22∶1[1]。骨肉瘤患者预后极差，目前我国骨肉瘤患者的5年生存率为37.5%～77.6%，而治疗后复发、肺部转移的患者，其平均生存时间更是不超过1年[2-3]。因此，为提高骨肉瘤患者的诊治率及改善预后，进一步探究骨肉瘤发病分子机制，找寻新的早期诊断、预后判断分子标志物及靶向治疗位点显得尤为迫切。

以往，骨肉瘤分子机制研究多集中于蛋白质编码基因，而将非蛋白质编码基因视为“垃圾”序列[4]。来源于非蛋白质编码基因的长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200 nt，不具有或仅具有少许蛋白质编码能力的内源性RNA序列[5]。近年来研究表明，LncRNA可在染色体修饰、转录及转录后水平等多层面上发挥调控作用，广泛参与肿瘤增殖、侵袭、转移、凋亡及耐药等生物学过程[6]。因LncRNA所显露出的抑瘤或致瘤效应，及其在肿瘤的诊治及预后判断中的潜在巨大作用，其已成为继microRNA后肿瘤研究的新热点。本文就LncRNA在骨肉瘤中的研究进展作一综述，旨在为骨肉瘤的进一步研究及提出新的有效的诊疗策略提供有益指导。

1 LncRNA对骨肉瘤发生、发展的影响

Li和Liu等[7-8]运用微矩阵基因芯片技术检测发现，较于瘤旁非肿瘤组织，骨肉瘤组织中某些LncRNA表达下调，另一些LncRNA表达上调。这些LncRNA可通过多种途径、机制对骨肉瘤发生、发展起抑制或促进作用。

1.1 LncRNA抑制骨肉瘤发生、发展

截止目前，细胞水平验证对骨肉瘤发生、发展起抑制作用的LncRNA有：MEG3[9]、TUSC7[10]、HIF2PUT[11]、LOC285194[12]等。Zhou等[9]在HCT116及U2OS细胞中发现，MEG3主要通过抑制MDM2的表达，使p53蛋白水平增高，促进p53蛋白结合至GDF15启动子近端的p53蛋白结合位点，促进GDF15表达而发挥抗肿瘤作用。骨肉瘤组织中TUSC7的表达水平降低，降低骨肉瘤细胞中TUSC7的表达，可促进肿瘤细胞增殖与集落形成，抑制细胞凋亡；在裸鼠异种肿瘤移植模型中，TUSC7低表达可显著促进骨肉瘤的生长[10]。Wang等[11]发现骨肉瘤组织、细胞中HIF-2 mRNA表达水平与HIF2PUT表达水平相关，HIF2PUT可通过HIF-2发挥骨肉瘤抑制作用，若降低HIF2PUT的表达，骨肉瘤细胞的增殖、侵袭与迁移能力明显提高，若增加HIF2PUT的表达则得到相反的结果。LOC285194位于osteo3q13.31位点，Pasic等[12]首先报道osteo3q13.31基因表达水平降低可能是骨肉瘤发生多步骤过程中的早期事件，但其具体机制还未明确。这些LncRNA对骨肉瘤发生、发展的抑制作用，提示我们可以上调某些LncRNA的表达来作为骨肉瘤的治疗策略，但此设想的具体临床运用尚需更深入的探究。

1.2 LncRNA促进骨肉瘤发生、发展

1.2.1 LncRNA通过影响基因转录发挥调节作用 LncRNA可在表观遗传及转录水平上调控、影响相关基因转录而发挥促瘤作用。例如：ZEB1-AS1可招募p300并结合至ZEB1基因启动子区域，诱导染色质结构开放，表观活化ZEB1基因，促使ZEB1基因转录，而促进骨肉瘤发生、发展[13]；EWSAT1可通过与HNRNPK(核内不均一核糖核蛋白)的相互作用在转录水平抑制LncRNA MEG63的表达，进而促进骨肉瘤的生长、侵袭和转移[14]。此外，Bida等[15]发现LncRNA MA-linc1至少可部分通过顺式作用抑制邻近pura基因的表达，促进细胞周期进程。有研究提示PACER可在转录水平上激活COX-2基因表达而促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移[16-17]；还有，陈声灿等[18]研究表明BCAR4可与GLI2靶基因(包括RPS3、IL-6、MUC5AC、TGF-β1等)的启动子相互作用，促进基因转录，使RPS3、IL-6、MUC5AC和TGF-β1等表达水平增高，促进骨肉瘤的进展、转移，若降低BCAR4的表达水平，骨肉瘤细胞的增殖、迁移能力则被抑制。

1.2.2 LncRNA在转录后水平发挥调节作用 Fang等[19]发现高浓度雌炔醇可上调骨肉瘤细胞中miR-9水平，促进miR-9与MALAT1的相互作用，使MALAT1降解而抑制骨肉瘤发展，这表明microRNA可通过LncRNA发挥作用。反之，我们也发现，有些LncRNA可通过作为竞争性内源RNA与microRNA结合，抑制microRNA活性而促进肿瘤发生发展。例如：LncRNA TUG1作为竞争性内源RNA与miR-9-5p、miR-335-5p结合，下调microRNA的水平，使POU2F1、ROCK1等表达水平升高，促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移，抑制凋亡[20-23]；LncRNA PVT1作为竞争性内源RNA而调节miR-195的水平，影响骨肉瘤细胞的生物学行为[24]。Chan等[25]的研究表明，小鼠成熟成骨细胞中Hedgehog(Hh)信号上调，可以使Yap1和LncRNA H19表达增高而促进成骨细胞型骨肉瘤的发生；在进一步研究中，Li等[26]发现LncRNA H19通过与miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等)的竞争性结合，造成miR-200水平降低，使miR-200与ZEB1 mRNA、ZEB2 mRNA的3’UTR的作用减弱，ZEB1和ZEB2表达水平增高，促进骨肉瘤转移和侵袭。Taniguchi等[27]应用合成的吡咯咪唑聚酰胺(Myc-6)可部分下调MALAT1水平而发挥骨肉瘤抑制作用；Luo等[28]研究揭示，MALAT1能直接与miR376a相互作用，降低miR376a水平，使TGF-α表达增高，促进骨肉瘤进展。

除与microRNA发生相互作用外，LncRNA还可通过与mRNA直接相互作用及其他多种方式在转录后水平发挥调节功能。例如：Sun等[29]研究显示FGFR3-AS1(LncRNA-BX537709)通过与其自然反义转录本FGFR3 3’UTR的相互作用，增加FGFR3 mRNA的稳定性，使FGFR3的含量增高，促进骨肉瘤发展；SATB2-AS1通过在翻译水平上影响SATB2基因的表达而促进骨肉瘤细胞的增殖、生长[8]；SPRY4-IT1通过翻译后修饰调节Snail蛋白的稳定性而抑制E-cadherin的表达水平，诱导骨肉瘤细胞的上皮间充质转换，促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[30]；MALAT1通过与SFPQ的相互作用，使SFPQ与PTBP2的相互作用减弱而影响骨肉瘤细胞的生物学行为[19]。

1.2.3 LncRNA通过影响信号通路发挥调控作用信号通路异常可影响LncRNA表达水平[25]，反之，LncRNA也可通过影响信号通路发挥肿瘤调控作用。例如：有研究在细胞水平揭示HNF1A-AS1、HOTTIP可通过激活Wnt/beta-catenin通路而促进骨肉瘤的进展，若降低骨肉瘤细胞中HNF1A-AS1、HOTTIP表达水平可下调Wnt/beta-catenin通路的活性，发挥骨肉瘤抑制作用，而应用Wnt/beta-catenin通路激活剂则可逆转HNF1A-AS1、HOTTIP低表达所引起的骨肉瘤抑制效应[31-33]。另外，Cai和Dong等[34-35]的研究分别揭示MALAT1可通过RhOA/ROCK通路和PI3K/Akt通路促进骨肉瘤的发生、发展，降低MALAT1水平后，骨肉瘤细胞中RhoA、ROCKs及PCNA、MMP-9、磷酸化的PI3Kp85α、Akt等表达水平均降低。Feng等[20]的研究表明TUG1至少可部分通过Akt通路促进骨肉瘤的发展。

p53蛋白是多条信号通路中的关键分子，多种LncRNA可通过影响p53蛋白而调节骨肉瘤发生发展，例如MEG3[9]、HOTAIR[36]、PANDA[37]等。HOTAIR即HOX转录反义RNA，研究表明HOTAIR至少可部分通过调控p53蛋白而促进骨肉瘤发生发展，降低骨肉瘤细胞中HOTAIR表达水平后，TGF-β和Bcl-2表达显著降低，p53和TNF-α表达水平显著增高，同时MMP-2和MMP-9的分泌减少[36，38]。还有研究显示，多柔比星或依托泊甙可造成骨肉瘤细胞DNA损伤并促进PANDA的表达，在DNA损伤情况下，PANDA通过提高p53蛋白稳定性而抑制骨肉瘤细胞凋亡，促进细胞生存[37]；而在DNA未受损情况下，PANDA通过抑制P18转录而促进肿瘤细胞G1-S期的进程，促进骨肉瘤细胞增殖[39]。

1.2.4 其他机制 LncRNA除由上述机制调控骨肉瘤发生、发展外，还可通过其他机制发挥作用。例如：Yin等[40]发现，骨肉瘤组织中FOXP4表达水平与LncRNA MFI2的表达水平正相关，MFI2可通过调节FOXP4的表达而促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Ruan等[41]的研究显示，骨肉瘤中AMOT mRNA表达水平与SNHG12表达水平正相关，SNHG12能通过上调骨肉瘤细胞中AMOT基因的表达而促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。Min等[42]的研究发现，ANCR在骨肉瘤中起致瘤作用，可以促进骨肉瘤的增殖，降低骨肉瘤细胞中ANCR水平可抑制骨肉瘤细胞的增殖和集落形成，同时骨瘤细胞内p21水平增高而CDK2水平降低。由此可见，这些LncRNA的作用机制并未十分清楚，需要进一步阐明。

还有些LncRNA也可促进骨肉瘤发生、发展。Naemura等[43]在非小细胞肺癌、宫颈癌细胞的研究中发现ANRIL可通过抑制与细胞周期相关的P15或其他基因的表达而促进肿瘤细胞增殖，而在骨肉瘤中，Wei等[44]研究表明，在缺氧条件下，HIF1-α通过直接结合ANRIL上游区域的缺氧反应元件，促进ANRIL的表达，进而促进缺氧骨肉瘤细胞侵袭，抑制凋亡，但ANRIL对骨肉瘤的具体促进机制并不明确。Sun等[45]发现骨肉瘤组织、细胞中HULC水平增高，降低U2OS细胞中HULC的表达可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为；Xia等[46]揭示骨肉瘤患者血清及骨肉瘤细胞中LncRNA 91H的水平增高，降低骨肉瘤细胞中91H水平可以抑制骨肉瘤细胞增殖，促进凋亡；Zhou等[47]降低骨肉瘤细胞CCAL的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力；Li等[48]的研究表明，调高UCA1表达可促进骨肉瘤的进展，而降低UCA1水平则抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，促进凋亡；另外，Fan等[49]发现转录因子Oct4可通过调节LncRNA AK055347促进骨肉瘤进展，降低Oct4的水平可以使AK055347的水平下降，并抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭，促进凋亡；这些LncRNA对骨肉瘤发生、发展的作用机制都有待研究。

2 LncRNA与骨肉瘤化疗敏感性

研究显示，某些LncRNA可影响骨肉瘤对化疗药物的敏感性。Zhu等[50]发现MG63/DXR细胞系中有些LncRNA表达水平上升，另一些LncRNA表达下降，其中LncRNA EST00000563280(即ODRUL、FOXC2-AS1)表达升高最多，NR-036444表达降低最多。他们预测ODRUL和NR-036444可能通过调节MAPK、NF-κB等通路中的某些基因及多种经典MDR基因(包括ABCB1、HIF1A、FOXC2等)的表达而影响MG63/DXR细胞对阿霉素的敏感性。随后，Zhang等[51]的细胞学研究证实，ODRUL可促进ABCB1基因的表达，使p-gp水平增高而增强骨肉瘤细胞对阿霉素耐药。

Wang等[52]研究发现，顺铂可使骨肉瘤细胞LINC00161表达增高，并通过LINC00161-miR-645-IFIT2路径促进骨肉瘤细胞凋亡；在对顺铂耐药的骨肉瘤细胞系中，LINC00161的表达水平降低，若调高LINC00161水平则可通过LINC00161-miR-645-IFIT2路径逆转骨肉瘤对顺铂的耐药性。Li等[32]发现，HOTTIP可通过激活wnt/β-catenin通路增强MG63细胞对顺铂的耐药性；若降低HOTTIP水平，则骨肉瘤细胞对顺铂敏感性增强。

Feldstein等[53]以依托泊甙处理骨肉瘤细胞使DNA损伤，可造成细胞凋亡和LncRNA XLOC006942(即ERIC)表达水平上升；若同时抑制ERIC的水平，则可进一步促进依托泊甙诱导的细胞凋亡，表明ERIC可抑制骨肉瘤细胞对依托泊甙的敏感性。

Bida等[15]的研究表明，LncRNA MA-linc1在促进骨肉瘤细胞周期进程及影响细胞对紫杉醇敏感性中具有作用。紫杉醇是通过抑制M期细胞微管解聚而诱导细胞凋亡的，若降低骨肉瘤细胞中MA-linc1水平，则可使M期肿瘤细胞增多，进而增强骨肉瘤细胞对紫杉醇的敏感性，使骨肉瘤细胞凋亡增加。

Fellenberg等[54]在一项包含35例高度恶性骨肉瘤患者的研究中发现：与化疗反应较好组相比较，化疗效应差组的MALAT1平均表达水平升高5.97倍，表明MALAT1水平与患者化疗敏感性显著相关，但MALAT1影响化疗敏感性的具体机制并不明确。

3 LncRNA表达水平与骨肉瘤患者预后的关系

骨肉瘤恶性程度高，易复发、转移，预后极差，早期诊断和准确判断预后有助于疾病的及时、规范治疗，改善临床结局，故积极挖掘、寻找合适的早期诊断和预后判断分子标志物具有重要临床意义[55]。LncRNA与骨肉瘤患者预后关系的相关研究结果如表1，但是，LncRNA能否作为骨肉瘤早期诊断和预后判断的分子标记物，还须长期临床实践的检验。

4 结语与展望

相对于蛋白编码基因及miRNA的研究，LncRNA的研究还处于起步阶段。截止目前，进行过细胞水平探究且与骨肉瘤密切相关的LncRNA仅几十个，其他LncRNA对骨肉瘤的影响及机制还未阐明。在这些已研究的LncRNA中，有些在骨肉瘤中低表达，有些在骨肉瘤中高表达，相关研究初步揭示了引起LncRNA在骨肉瘤中异常表达的机制以及LncRNA异常表达对骨肉瘤增殖、侵袭、转移、凋亡和耐药性等的影响及作用机制，但更具体的机制还需更深入的研究。上述研究为进一步寻找骨肉瘤的治疗方法和逆转骨肉瘤耐药奠定了理论基础，但是否可以利用阻断在骨肉瘤中过表达的LncRNA或者上调在骨肉瘤中低表达的LncRNA作为潜在的骨肉瘤治疗和逆转骨肉瘤耐药的策略，亦有待更深入的探索。此外，LncRNA能否作为骨肉瘤患者临床诊断与判断预后的分子标志物，也需要经过长期的临床实践检验。在研究中，研究者通常获取骨肉瘤组织来测定LncRNA水平，但在临床运用中，患者的组织并不容易获得，因此通过血液、尿液等标本来测定LncRNA水平将值得研究与关注。

LncRNA保守，但其原始序列所包含的信息少，功能难以预测，序列相差很大的LncRNA可能具有相似的功能，序列相似的LncRNA又可能功能相差很大。另外，同一种LncRNA在骨肉瘤中可能有多种作用机制，不同机制间错综复杂的网络关系都会给研究带来巨大困难，探索LncRNA与骨肉瘤的关系是一项长期而艰巨的任务。随着生命科学技术的进步，对LncRNA的认识将越来越深刻，LncRNA在骨肉瘤中的作用机制也将越来越明确，相信在不久的将来，具有细胞和组织特异性的LncRNA将成为一类全新的有效的骨肉瘤新药治疗靶点及诊断和预后判断的分子标志物。

表1 LncRNA表达水平与骨肉瘤患者预后的关系Table 1 Associations between LncRNA expression and prognosis of osteosarcoma patients

*：HIF2PUT表达水平与骨肉瘤患者预后的关系存在矛盾

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吴发帅，男，1991年生，博士研究生，E-mail：18771036347@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：szwjj@medmail.com.cn

R738.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.022

(2017-02-28 收稿)