miR-186对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制

万春花， 蔡 钧， 杨世疆， 吴景冬， 郭清皓， 蒋林涛△

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 1麻醉科 2急诊创伤外科，武汉 430014

miR-186对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制

万春花1， 蔡 钧2， 杨世疆2， 吴景冬2， 郭清皓2， 蒋林涛2△

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院1麻醉科2急诊创伤外科，武汉 430014

目的研究转染miR-186对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响并探讨作用机制。方法采用荧光定量PCR检测miR-186在胶质母细胞瘤细胞系U251、U87-MG及正常星形胶质细胞系HA1800中的表达水平，将U251细胞分为miR-186模拟物组和对照组，分别转染miR-186模拟物和阴性随机对照序列，并用荧光定量PCR检测miR-186在两组中的表达量。采用CKK-8法检测两组细胞细胞增殖能力，流式细胞仪测定两组细胞凋亡率，Western blot分析Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Cyclin D1蛋白的表达。结果miR-186低表达于胶质母细胞瘤细胞系U251及U87-MG，高表达于正常星形胶质细胞系HA1800。转染24、48、72及96 h后，miR-186模拟物组细胞增殖(A450nm值)低于对照组(均P<0.05)。转染48 h后，miR-186模拟物组凋亡率高于对照组；miR-186模拟物组Caspase-3、9的表达量高于对照组(均P<0.01)，Caspase-8与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。miR-186模拟物组Cyclin D1表达水平较对照组明显降低(P<0.01)。结论miR-186抑制胶质母细胞瘤细胞增殖能力，并诱导凋亡，其机制可能与上调Caspase-3、9，下调Cyclin D1有关。

miR-186； 胶质母细胞瘤； 增殖； 细胞凋亡

胶质母细胞瘤是成年人最常见的原发性脑部肿瘤，具有很强的侵袭和增殖能力，病死率很高，患者中位生存期一般不超过1年[1-2]。MicroRNAs (miRNA)是一类内源性的非编码RNA，长度在21～25 nt，具有在转录后水平调控靶基因表达的功能[3-4]。miRNA参与调节细胞生长、增殖、凋亡，与肿瘤的发生和发展有着密切关系[5]。miRNA-186被证实在神经内分泌肿瘤患者肿瘤组织中表达水平降低，且参与神经内分泌肿瘤增殖、浸润、转移等过程[6]。它通过靶向SKP2抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖，并诱导凋亡[7]。miRNA-186在非小细胞肺癌中通过靶向结合MAP3K2基因而发挥抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的作用[8]。细胞周期失调是发生癌变的重要原因，细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是G1期所必须的核蛋白，是G1/S期关键限速点的重要调节因子[9-10]。细胞凋亡是细胞死亡的调节性生理过程，Caspase引发的一系列级联反应被认为是细胞凋亡过程的重要途径[11]。本研究观察了miR-186基因转染对胶质母细胞瘤U251细胞系增殖和凋亡的影响，分析了miR-186对细胞周期蛋白Cyclin D1及Caspase家族重要成员3、8、9的调控作用，探讨miR-186在胶质母细胞瘤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

胶质母细胞瘤细胞系U251、U87-MG及正常星形胶质细胞系HA1800购自中国医学科学院实验医学中心，DMEM细胞培养液、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司，实验所需的一抗购自美国Cell Signaling公司，二抗购自武汉博士德生物科技有限公司， miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501)购自北京天根生物科技有限公司，All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 检测试剂盒购自北京亚太恒信生物科技有限公司，SYBR Green Reagents 购自TaKaRa公司，Caspase-3、8、9活性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，miR-186 mimics及scramble均由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2 细胞培养、转染及分组

胶质母细胞瘤细胞系U251、U87-MG及正常星形胶质细胞系HA1800均加入DMEM培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养48 h后消化传代。将胶质母细胞瘤细胞系U251分为miR-186模拟物组和对照组，分别转染miR-186 mimics和阴性随机对照序列scramble,采用Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen,USA)对两组进行转染。miR-186模拟物组转染序列：miR-186 mimics上游 5′-CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU-3′,miR-186 mimics下游 5′-CCCAAAAGGAGAAUUCUUUG-UU-3′；对照组转染序列：miR-186 NC上游 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,miR-186 NC下游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.3 miRNA提取及qRT-PCR检测

用miRcute miRNA提取分离试剂盒按操作说明书提取细胞系中miRNA ，采用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 检测试剂盒进行反应，操作按试剂盒说明书进行。反应体系：2×All-in-OneTMqRT-PCR Mix 10 μL、引物序列(10 μmol/L)1 μL、反转录cDNA 1 μL，加双氧水至20 μL。反应条件：预变性95℃ 10 min、变性95℃ 10 s、退火60℃ 20 s、延伸72℃ 30 s，共35周期。miR-181引物序列：上游5′-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3′，下游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，U6小核引物序列：上游5′-CGCAAGGATGACACG-3′；下游5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。采用ABI Prism 7700型荧光实时定量PCR仪进行检测分析，以U6小核RNA作为内参，2-ΔΔCt法定量分析miR-186相对表达水平。

1.4 细胞增殖能力测定

采用CCK-8法测定两组细胞增殖能力。将miR-186模拟物组和对照组两组细胞消化成单细胞悬液后，在96孔板上以2×103个/孔接种，每孔培养液体积200 μL。在分别培养0、24、48、72 、96 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光值(A)，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制胶质瘤细胞增殖曲线。

1.5 细胞凋亡能力测定

采用流式细胞术测定两组细胞凋亡能力。用Annexin Ⅴ/PI 染色检测，将两组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重悬，加入相应比例的Annexin Ⅴ抗体，避光染色10 min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin Ⅴ阳性细胞比例来确定细胞凋亡的变化。

1.6 Caspase-3、8、9酶活性测定

将miR-186模拟物组和对照组两组细胞裂解后，离心处理(1 000 r/min,5min)，按Caspase-3、8、9活性检测试剂盒说明书进行检测。利用96孔板，将细胞裂解液与分别含有Caspase-3、8、9底物的反应液共同孵育4 h，然后用TECAN酶标仪读取405 nm的吸光度值，计算相对活力值。

1.7 Cyclin D1蛋白表达量测定

采用Western blot法。将miR-186模拟物组和对照组两组细胞用RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min后，变性、上样，以每孔30 μg总蛋白上样，浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶100 V电泳2 h。常规湿法转膜，加入Cyclin D1一抗(1∶300)，37℃孵育4 h，二抗(1∶500)孵育过夜， ECL液显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/ GAPDH测定值，实验重复3次，取平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-186低表达于胶质母细胞瘤细胞系

荧光定量PCR结果示，以正常星形胶质细胞系HA1800中 miR-186相对表达量为1.0，miR-186在胶质母细胞瘤细胞系U251、U87-MG中的相对表达量分别是(0.20±0.04)、(0.30±0.05)，明显低于正常星形胶质细胞系HA1800(均P<0.01)，见图1。

与HA1800细胞比较，**P<0.01图1 miR-186在胶质母细胞瘤细胞系U251、U87-MG及正常星形胶质细胞系中的表达Fig.1 The expression of miR-186 in glioblastoma cell line,U251 and U87-MG,and normal astrocyte cell line HA1800

2.2 miR-186过表达抑制胶质母细胞瘤细胞增殖

转染miR-186 mimics 24 h后，荧光定量PCR结果示，以阴性对照组中miR-186表达量为1.0，胶质母细胞瘤系U251中miR-186的相对表达量是(8.00±0.63)，明显高于阴性对照组(P<0.01)，见图2A。

采用CCK-8法测定U251细胞增殖。转染后0、24、48、72及96 h后，miR-186模拟物组与对照组的A450nm值分别为(0.33±0.03)vs.(0.35±0.04)、(0.43±0.08)vs.(0.75±0.10)、(0.72±0.09)vs.(1.67±0.25)、(1.33±0.15)vs.(2.43±0.19)及(1.92±0.20)vs.(3.78±0.32) ，除0 h时两组差异无统计学意义外，其余时间点差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图2B。

2.3 miR-186过表达诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡

转染miR-186模拟物48 h后，流式细胞术测定两组细胞的凋亡率。miR-186模拟物组凋亡率为 (20.0±1.5)%，阴性对照组凋亡率为 (8.0±1.0) %， miR-186模拟物组凋亡率高于对照组(P<0.01)，见图3A。

A：miR-186在miR-186模拟物组及阴性对照组中的表达；B：CCK-8实验示miR-186模拟物组及阴性对照组的增殖曲线；与阴性对照组比较，*P<0.05 **P<0.01图2 miR-186过表达抑制胶质母细胞瘤细胞增殖Fig.2 Over-expression of miR-186 inhibits the proliferation of glioblastoma cells

Caspase-3、8、9活性检测试剂盒检测Caspase-3、8、9活力。分别以阴性对照组Caspase-3、8、9的活力值为1.0，miR-186模拟物组Caspase-3、9的相对活力分别为(2.1±0.2)、(2.2±0.1)，均显著高于阴性对照组(均P<0.01)，而Caspase-8相对活力为(1.1±0.1)，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。

A：miR-186模拟物组与阴性对照组凋亡率的比较；B：miR-186模拟物组与阴性对照组Caspase-3、8、9活性比较；与阴性对照组比较，**P<0.01图3 miR-186过表达诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡Fig.3 Over-expression of miR-186 induces the apoptosis of glioblastoma cells

2.4 miR-186下调Cyclin D1表达

Western blot结果示，以阴性对照组为1.0，miR-186模拟物组Cyclin D1相对表达量为(0.33±0.05)，明显低于阴性对照组(P<0.01)，见图4。

A：Western blot示miR-186模拟物组与阴性对照组Cyclin D1的表达；B：miR-186模拟物组与阴性对照组Cyclin D1相对表达量的比较；与阴性对照组比较，**P<0.01图4 miR-186下调Cyclin D1表达Fig.4 miR-186 down-regulates expression of Cyclin D1

3 讨论

胶质母细胞瘤是最常见的原发性恶性肿瘤，年发病率约为5.26/10万，每年新增患者约17 000人[12-13]。其发病机制尚不清楚，目前治疗上仍以手术切除、放疗同时联合替莫唑胺化疗为主，但患者普遍预后差、生活质量低、生存期短[14]。miRNA是一种内源性非编码小RNA，在调控细胞增殖、分化、凋亡及多种信号途径中起重要作用，参与肿瘤的发生和发展[15]。比如，miR-21通过调控程序性细胞死亡因子参与乳腺癌细胞增殖[16]；miR-34a通过直接抑制CD44抑制前列腺癌干细胞的转移[17]。miR-186也被证实与肿瘤的发生有密切联系，miR-186干扰肺腺癌细胞周期进程，且与预后不良有关[18]；miR-186调控PTTG1表达促进非小细胞肺癌迁移和侵袭[19]；miR-186靶向NSBP1抑制膀胱癌的生长和转移[20]。但是，miR-186在胶质母细胞瘤中的作用尚不清楚。

细胞凋亡是导致细胞程序性死亡的特定过程，通过激活线粒体通路或死亡受体通路或内质网通路等途径而诱发[21-22]。线粒体介导的细胞凋亡通路通过激活细胞色素C释放到细胞质中，与Apaf1结合形成复合物，引起Caspase-9等级联反应，最后导致Caspase-3的激活，继而导致凋亡的发生[23]。本研究发现，miR-186模拟物组细胞凋亡率是(20.0±1.5)%,而对照组是(8.0±1.0)%，表明miR-186上调表达可诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡。通过检测蛋白活力发现，miR-186模拟物组中Caspase-3和Caspase-9蛋白活力显著升高。故而证实miR-186过表达激活了线粒体凋亡途径进而促进胶质母细胞瘤U251细胞凋亡。

死亡受体如Fas和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，通过招募Fas相关死亡结构域和Caspase-8同型二聚体而自动酶解，Caspase-8被激活并释放到胞质中，作用于Caspase-3并使Caspase-3激活，从而诱导凋亡[24]。本研究中，蛋白活力检测表明miR-186模拟物组与对照组中Caspase-8蛋白活力无显著差异，表明细胞表面死亡受体途径没有参与到miR-186诱导的胶质母细胞瘤U251细胞凋亡过程。

细胞周期紊乱是导致恶性肿瘤转化和失控性增殖的重要原因[25]。细胞周期调控激酶复合物CDK/Cyclin是调控细胞周期的关键因素，G0/G1期阻滞是抑制细胞增殖的重要原因[26-28]。本研究也探讨了miR-186过表达是否引起U251细胞阻滞于G0/G1期。Western blot结果显示，miR-186模拟物组中Cyclin D1(G1/S转换期的重要正向调控因子[29])的表达水平较对照组明显下降。这表明，miR-186基因过量表达引起U251细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞的有丝分裂，进而抑制胶质母细胞瘤增殖过程。

综上，本研究发现转染miR-186后，能显著降低胶质母细胞瘤U251细胞的增殖能力，并促进凋亡，显著提高细胞凋亡蛋白酶Caspase-3、Caspase-9的活力，降低细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。说明，miR-186通过参与调控细胞凋亡和细胞周期途径而抑制胶质母细胞瘤U251的增殖能力。miR-186有望成为胶质母细胞瘤治疗的潜在标志物，为肿瘤治疗提供了新靶点及思路。

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EffectofmiR-186onProliferationandApoptosisofGliblastomaCellsandItsMechanisms

Wan Chunhua1, Cai Jun2, Yang Shijiang2etal

1DepartmentofAnesthesiology2DepartmentofEmergencyTraumaSurgery,WuhanCentralHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

ObjectiveTo explore the role of miR-186 transfection in the proliferation and apoptosis of glioblastoma cells,as well as the regulatory mechanism.MethodsReal-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to detect the expression of miR-186 in glioblastoma cell line,U251 and U87-MG,and normal astrocyte cell line HA1800.The U251 cells were divided into miR-186 mimic group and control group,which were transfected with miR-186 mimics and scramble sequence,respectively.MiR-186 expression levels of these two groups were detected by qRT-PCR.Cell proliferation ability of the two groups was evaluated by CKK-8 assay.Cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9,and Cyclin D1 protein levels were quantified by Western blotting.ResultsLower miR-186 levels were observed in glioblastoma U251 and U87-MG cells than in normal brain cell line.However,miR-186 level was significantly higher in miR-186 mimic group than in control group (P<0.01).After transfection for 24,48,72,and 96 h,A450 nmvalues were lower in the miR-186 mimic group than in the control group (allP<0.05).After transfection for 48 h,apoptosis rate was higher in the miR-186 mimic group than in the control group.Caspase-3 and Caspase-9 were significantly higher in the miR-186 mimic group than in the control group (bothP<0.01).However,there was no significant difference in the expression of Caspase-8 between miR-186 mimic group and control group(P>0.05).Cyclin D1 protein expression was significantly lower in the miR-186 mimic group than in the control group (P<0.01).ConclusionMiR-186 inhibits the proliferation and induces apoptosis of U251 cells via up-regulating Caspase-3 and 9 and down-regulating Cyclin D1.

miR-186; glioblastoma; proliferation; apoptosis

万春花，女，1977年生，主治医师，E-mail:wanchunhuahp@tom.com

△通讯作者，Correspondina author，E-mail:lintaojiang99@21cn.com

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.005

(2017-05-17 收稿)