癌-睾丸抗原OY-TES-1致敏的树突状细胞体外抗胶质瘤的免疫效应*

刘 畅， 闭水清， 张庆梅， 谢小薰， 肖绍文△，付 骏， 葛盈盈， 陈 芳， 罗 彬△， 李 静

1广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁 530021 2广西医科大学组织学与胚胎学教研室，南宁 530021 3广西医科大学基础医学研究重点实验室，南宁 530021

癌-睾丸抗原OY-TES-1致敏的树突状细胞体外抗胶质瘤的免疫效应*

刘 畅1， 闭水清1， 张庆梅2，3， 谢小薰2，3， 肖绍文1△，付 骏2， 葛盈盈2，3， 陈 芳2，3， 罗 彬2，3△， 李 静2

1广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁 5300212广西医科大学组织学与胚胎学教研室，南宁 5300213广西医科大学基础医学研究重点实验室，南宁 530021

目的研究负载癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)OY-TES-1的树突状细胞(dendritic cell，DC)体外抗胶质瘤的细胞免疫效应。方法细胞因子联合诱导HLA-A2+健康人外周血单核细胞为DC，采用OY-TES-1重组蛋白致敏DC，流式细胞术检测成熟DC表型分子；进而使DC诱导同体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，CCK8检测T细胞增殖情况，ELISPOT检测IFN-γ含量，乳酸脱氢酶释放法检测CTL对胶质瘤细胞U251和A172的杀伤作用。结果负载OY-TES-1的DC低表达CD14，而高表达CD1a、CD83和CD80表型分子，能明显促进CD8+T细胞的增殖及其IFN-γ的分泌(P<0.05)；而OY-TES-1特异性CTL在效靶比为50∶1时对HLA-A2+和OY-TES-1+U251、HLA-A2-和OY-TES-1+A172均有明显杀伤作用(均P<0.05)，但其对U251的杀伤作用更强。结论体外用OY-TES-1重组蛋白致敏的DC可诱导特异性抗胶质瘤免疫应答，提示OY-TES-1可能成为胶质瘤免疫治疗的靶点。

树突状细胞； OY-TES-1； 胶质瘤； 免疫治疗

胶质瘤(glioma)是一类常见的侵袭性和恶性程度非常高的神经系统肿瘤，患者中位生存期通常不超过2年，预后不良。传统治疗仍然采用手术切除为主，术后辅以放疗和化疗，但由于肿瘤细胞的侵袭性生长、脑解剖部位的特殊性以及血脑屏障的存在等多种影响因素，胶质瘤的传统治疗效果并不令人满意，因此急需探索新的治疗方法。其中，肿瘤免疫治疗由于具有创伤小、特异性强的特点而备受关注，并且，以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的肿瘤免疫治疗是近年来的研究热点之一[1-3]。

DC是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)。由于未成熟DC能摄取加工抗原，而成熟DC则能有效提呈可溶性抗原，同时激活静息和幼稚的T细胞，因此能够启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。经研究证实，利用肿瘤抗原、肿瘤细胞RNA和肿瘤细胞裂解物致敏DC，可在体内外有效地诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，从而激发机体产生特异性抗肿瘤免疫效应[4]。在过去20年里，基于DC的抗肿瘤疗法不断发展，并且展现出了良好的临床应用前景[5]。

癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是一类具有免疫原性，高度肿瘤特异性的抗原，仅表达于肿瘤细胞和生殖细胞，而在除睾丸之外的正常组织基本不表达[6-10]，因此被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶点[11]。OY-TES-1属CTA中一员[12]，在CT抗原数据库中又称CT23(http：//www.cta.lncc.br)。研究显示，OY-TES-1在多种肿瘤组织中表达[13-16]，并在肿瘤患者体内能够引起体液免疫反应[13-14，17]。目前已研究鉴定出一个OY-TES-1的HLA-A24限制性表位，经证实该表位能在体外引起细胞免疫反应[18]。同时，根据我们前期的研究显示17.14%的胶质瘤患者血清中存在OY-TES-1抗体，而正常人体内血清均为OY-TES-1抗体阴性[17]。由此可见，将OY-TES-1用于肿瘤免疫治疗具有潜在的临床应用价值。所以在此基础上，本研究拟采用OY-TES-1重组蛋白致敏DC，然后使其诱导同体T细胞产生CTL，观察CTL对胶质瘤细胞的特异性杀伤效应，为今后开发基于OY-TES-1的肿瘤疫苗提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)及其与OY-TES-1重组蛋白(OY-MBP)由本课题组制备；胶质瘤细胞株U251(HLA-A2+)和A172(HLA-A2-)购自中科院上海细胞库，按照常规方法进行培养；人淋巴细胞分离液(Ficoll)购于Sigma公司；细胞因子rhTL-4、rhTNF-α、rhGM-CSF购于Peprotech公司；rhIL-2购于山东泉港药业有限公司；PE标记的小鼠抗人CD83、CD80、CD14、IgG2b和FITC标记的小鼠抗人CD1a、HLA-DR、IgG1、HLA-ABC抗体和HLA-A2抗体购于eBioscience公司；CD8+细胞磁珠分离试剂盒购于德国美天旎公司；IFN-γ ELISPOT试剂盒购于达科为公司；非放射性细胞毒检测试剂盒购于Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DC的体外诱导培养、致敏、表型分析 取50 mL HLA-A2+健康人外周血，Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMC)，将3×106/mL的PBMC加入6孔培养板中培养2 h后，收集贴壁单核细胞，用含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的RPMI 1640进行DC诱导培养，隔日半量换液，同时补充细胞因子，每天用倒置相差显微镜观察细胞生长和形态变化。

调整DC细胞密度至1×106/mL，在培养的第6天加入成熟因子rhTNF-α(50 ng/mL)，同时补充含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的完全培养液RPMI 1640。在培养的第7天分别加入不同的蛋白100 μL(100 μg/mL)，分为以下3组：OY-TES-1重组蛋白组(OY/DC)、MBP组(MBP/DC)和不加任何蛋白的对照组(PBS/DC)。3组细胞在蛋白致敏24 h后全量换液，同时补充含rhTNF-α、rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养液继续培养，以备后续实验。

收集培养到第8天的致敏DC，调整细胞密度至1×106/mL，然后加入CD14、CD1a、CD80和CD83抗体20 μL，4℃避光孵育30～60 min后，采用流式细胞仪进行检测。

1.2.2 效应T细胞的分离 收集同体PBMC培养2 h后的非贴壁细胞，调整细胞密度，采用磁珠阳选法分离CD8+T淋巴细胞。

1.2.3 混合淋巴细胞反应 收集致敏72 h后的DC(刺激细胞)，加入25 μL/mL丝裂霉素C培养30 min后，分别调整细胞密度为1×105/mL和1×104/mL，分别以DC∶T为1∶1和1∶10加入上述分离的CD8+T淋巴细胞(反应细胞)混合培养获得CTL细胞，每组设3个复孔，终体积为200 μL，置培养箱中培养72 h；于培养结束前2 h加入CCK-8溶液(20 μL/孔)，测各孔吸光度值(A450nm)，计算刺激指数(stimulation index，SI)：SI=(实验孔A值-本底A值)/(空白对照孔A值-本底A值)。

1.2.4 ELISPOT法检测IFN-γ 将致敏DC和CD8+T淋巴细胞共培养，诱导后者为CTL，采用ELISPOT检测培养液中CTL细胞IFN-γ的分泌量，按照试剂盒说明书进行，共分为6组：背景负对照组(培养液)、负对照组(T细胞)、正对照组(阳性刺激剂+T细胞)、DC组(PBS/DC+T细胞)、MBP/DC组(MBP/DC+T细胞)和OY/DC组(OY /DC+T细胞)。

1.2.5 CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用 采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定CTL对靶细胞的毒性。将CTL和靶细胞U251和A172细胞分别按12.5∶1、25∶1、50∶1的效靶比加入96孔板共孵育，4 h后加25 μL裂解液至靶细胞最大释放孔，继续孵育45 min，然后收集各组上清液至另一培养板，加入底物缓冲液，避光放置30 min后终止反应，酶标仪测其A490nm，并计算杀伤率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学处理，每组数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，并用最小显著差法进行组间的多重比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成熟DC表型分析

流式细胞仪检测培养至第8天的成熟DC表型分子，结果显示：CD14为0.65%、CD1a为76.83%、CD83为80.25%、CD80为79.02%(图1)，表明经细胞因子诱导后大部分单核细胞能转变成DC，且呈成熟DC表型。

A：IgG1 0.11%；B：CD14 0.65%；C：CD1a 76.83%；D：IgG2b 1.53%；E：CD83 80.25%；F：CD80 79.02%图1 流式细胞仪检测DC表型分子Fig.1 Detection of DC phenotype by flow cytometry

2.2 混合淋巴细胞反应

用CCK-8法检测DC诱导CD8+T的增殖能力，结果显示：OY/DC组能明显促进CD8+T细胞的增殖，与MBP/DC组和PBS/DC组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)；在不同的2种DC∶T体系中，1∶1的刺激效应更强(图2)。

与OY/DC组比较，*P<0.05图2 DC诱导同体T淋巴细胞增殖能力测定Fig.2 Proliferation of homologous T lymphocyte induced by DC

2.3 IFN-γ分泌量的检测

为了进一步明确致敏DC诱导CD8+T细胞免疫反应能力，我们采用ELISPOT法检测IFN-γ分泌水平，结果显示：OY/DC组和正对照组能明显上调CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ，与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4 CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用

LDH释放法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果显示：在各种效靶比中，OY-DC所诱导的CTL对靶细胞的杀伤效率均较其它对照组高，但仅效靶比为50∶1时差异有统计学意义(P<0.05)，且在该效靶比时，CTL对HLA-A2+和OY-TES-1+的U251细胞比HLA-A2-和OY-TES-1+的A172细胞具有更强的杀伤作用，此外，我们也观察到两组靶细胞均出现随着效靶比的增高，CTL对其杀伤作用也随之增强的趋势(图4)。

与正对照组比较，*P<0.05；与OY/DC组比较，#P<0.05图3 ELISPOT法分析分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量Fig.3 The number of CD8+ T cells secreting IFN-γ was analyzed by ELISPOT

与OY/DC-CTL+A172组比较，*P<0.05；与OY/DC-CTL+U251组比较，#P<0.05图4 不同效应CTL对胶质瘤的特异性杀伤率Fig.4 Specific killing rate of different CTL in glioma

3 讨论

DC是目前发现的体内功能最强，也是唯一能激活初始T淋巴细胞的专职APC[5]。DC来源于骨髓CD34阳性细胞，能高水平地表达与抗原递呈有关的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子以及多种共同刺激分子，能够摄取和处理抗原，并递呈给T细胞，因此DC能够激活相应的CD4+T细胞和CD8+T细胞。虽然DC在人体内分布广泛，但含量稀少，占PBMC的1%以下，所以导致了体外或体内研究其生物学特性具有一定困难，同时也限制了DC疫苗在临床的广泛应用。随着对DC基本生物过程的不断认识，如今已可以从外周血、骨髓、脐带血等组织的单核细胞或造血干细胞CD34+中成功诱导分化为具有免疫功能的DC，其中从PBMC诱导培养DC的方法，由于取材容易已在临床上推广应用。本研究通过采用先由外周血将PBMC常规分离，经反复贴壁后获得粘附的单核细胞，再用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α联合诱导培养DC，并对培养的DC进行了鉴定。我们选择了4个反映DC成熟状况的细胞表面分子进行检测，其中CD14是单核细胞特异性表达分子，培养至第8天时其表达已明显减少；CD83和CD1a是DC相对成熟的表面分子，CD80是与DC抗原提呈功能密切相关的表面分子，这些细胞表面分子的表达在培养至第8天的DC中已明显提高，证明DC已趋成熟。

致敏的DC具有活化T淋巴细胞的功能，为验证DC这一功能，我们将经蛋白致敏的DC与自体T淋巴细胞共同培养，分别检测T淋巴细胞的增殖情况及其IFN-γ分泌量。结果显示，经OY-TES-1融合蛋白致敏后的DC能显著促进T淋巴细胞的增殖，并使IFN-γ分泌量明显增加。此外，由于DC受到抗原特异或非特异性的刺激后均会促进CD8+T淋巴细胞活化和细胞因子分泌的增加，考虑到本研究所用的OY-TES-1蛋白是一种包含了MBP的重组蛋白，因此我们设立了MBP致敏DC组作为对照组来排除MBP蛋白对DC的作用。结果显示，虽然各种蛋白致敏DC后均能促进T淋巴细胞活化，但经OY-TES-1重组蛋白致敏的DC能更有效刺激T淋巴细胞的增殖并增加CD8+T淋巴细胞IFN-γ的分泌量。而DC促进淋巴细胞分泌IFN-γ的机制，我们推测可能与IFN-γ反向调节促进DC成熟活化有关，进而又促进了T淋巴细胞的活化，可能形成了具有放大效应的反馈环路。CD8+T淋巴细胞经DC刺激转化而成的CTL是极其重要的肿瘤杀伤细胞，并且IFN-γ是CTL发挥杀伤肿瘤细胞作用的主要细胞因子。

CTL在肿瘤免疫治疗中发挥十分重要的作用，其介导细胞毒效应的多为CD8+，其杀伤效应受MHC-Ⅰ类分子限制，通过释放毒性颗粒及死亡受体途径而介导靶细胞死亡。此外约10%的CTL为CD4+，其杀伤效应受MHC-Ⅱ类分子限制，主要通过分泌细胞因子以及激活巨噬细胞从而介导细胞免疫效应。鉴于我国大部分人群HLA抗原表型为HLA-A*02阳性，因此我们首先研究基于HLA-A*02的免疫治疗策略。本研究从HLA-A2+外周血中由DC前体细胞诱导培养出DC，然后再采用OY-TES-1重组蛋白致敏该DC，并将致敏后的DC与自体T细胞共同孵育，诱导出OY-TES-1特异性CTL，使得这些CTL能够特异性杀伤HLA-A2+并表达OY-TES-1的胶质瘤细胞。而对HLA-A2-的胶质瘤细胞，尽管其OY-TES-1蛋白表达较高，但CTL对其杀伤作用明显减弱，这表明CTL的特异性杀伤作用具有MHC-Ⅰ类分子限制性。另外，本研究还提示了HLA-A2+的OY-TES-1特异性CTL对HLA-A2-的胶质瘤细胞株也有一定的杀伤作用，对于这一现象，我们推测可能有以下原因：①可能与MHC的兼并性有关；② HLA-A24单体型是许多种群中最为常见的等位基因之一，尤其在中国人群有较高的表达(33%)，本实验中献血者与胶质瘤细胞株可能也同时表达HLA-A24。

综上所述，OY-TSE-1融合蛋白致敏DC而诱导的CTL对胶质瘤细胞株具有较强的杀伤作用，这为临床上将该蛋白运用于胶质瘤的免疫治疗提供了初步的实验依据。本实验也存在一些不足之处：如DC的活化和成熟状态不稳定，这将影响后续的实验；未进行体内实验。针对这些问题，在我们接下来的实验中可进一步优化DC的培养，并进行动物体内试验，从而进一步探讨负载OY-TES-1抗原的DC瘤苗对肿瘤的杀伤效应。

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ImmuneEffectagainstGliomaMediatedbyDendriticCellsPulsedwithCancer-testisAntigenOY-TES-1InVitro

Liu Chang1，Bi Shuiqing1，Zhang Qingmei2，3etal

1DepartmentofNeurosurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofHistologyandEmbryology，3CentralLaboratory，SchoolofPre-ClinicalMedicine，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

ObjectiveTo detect immune effect against glioma mediated by dendritic cells(DCs)pulsed with cancer-testis antigen(CTA)OY-TES-1invitro.MethodsCytokines induced HLA-A2+healthy human peripheral blood mononuclear cells into DCs，which were loaded by OY-TES-1 recombinant protein.Then flow cytometry was used to detect the phenotype molecules of mature DC.T cell proliferation was tested by CCK8，and IFN-γ level was assessed by ELISPOT assay.Lactate dehydrogenase release method was used for the killing effect of CTL on glioma cells U251 and A172.ResultsDCs loaded OY-TES-1 showed the low expression of CD14 and high expression of CD1a，CD83 and CD80，and could significantly promote the proliferation of CD8+T cells and the secretion of IFN-γ(P<0.05).OY-TES-1 specific CTL had significant killing effect on HLA-A2+and OY-TES-1+U251 and HLA-A2-and OY-TES-1+A172 at the target-target ratio of 50∶1(P<0.05)，but its killing effect was much stronger on U251 than on A172.ConclusionDCs loaded OY-TES-1 can induce specific anti-glioma immune response，suggesting that OY-TES-1 may be the target for glioma immunotherapy.

dendritic cell； OY-TES-1； glioma； immunotherapy

*国家自然科学基金资助项目(No.81360371，No.81360374，No.81460382，No.81560408)；广西自然科学基金资助项目(No.2016 GXNSFAA380257，No.GXNSFBA380159)；广西生物靶向诊治研究重点实验室开放课题(No.GXSWBX201505)；广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室自主研究课题(GKE2015-ZZ02)

刘 畅，男，1989年生，硕士研究生，E-mail：249738984@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：xsw57@yahoo.com(肖绍文)；1561148680@qq.com(罗彬)

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.003

(2017-08-23 收稿)