贞清方通过抑制活性氧产生改善2型糖尿病大鼠勃起功能*

李明超， 林 煌， 郭水明， 刘 卓， 王 涛△， 王少刚， 刘继红△， 叶章群

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1泌尿外科(泌尿外科研究所) 2肾内科，武汉 430030

论 著

贞清方通过抑制活性氧产生改善2型糖尿病大鼠勃起功能*

李明超1， 林 煌1， 郭水明2， 刘 卓1， 王 涛1△， 王少刚1， 刘继红1△， 叶章群1

华中科技大学同济医学院附属同济医院1泌尿外科(泌尿外科研究所)2肾内科，武汉 430030

目的探索贞清方能否通过减少活性氧(ROS)的产生来改善糖尿病引发的勃起功能障碍(ED)。方法30只8周龄雄性SD大鼠，随机分为对照组(Con组)，糖尿病ED组(DM组)，糖尿病ED+贞清方组(ZQR组)，其中DM组和ZQR组均采用高糖高脂喂养4周后行腹腔单次小剂量(30 mg/kg)注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病模型，并于10周后使用阿扑吗啡(APO)筛选2型糖尿病ED大鼠。ZQR组使用贞清方4 g/(kg·d)灌胃，DM组和Con组给予等量的生理盐水灌胃。4周后测各组大鼠血糖、三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)、平均动脉压(MAP)、阴茎海绵体内压(ICP)、丙二醇(MDA)，通过Western blot检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)的蛋白表达。结果Con组和ZQR组大鼠血糖、TC、TG、和MDA水平均明显低于DM组(均P<0.05)；Con组和ZQR组的最大阴茎海绵体内压/平均动脉压(maxICP/MAP)明显高于DM组(P<0.05)；Western blot结果显示eNOS和nNOS在Con组和ZQR组的表达明显高于DM组。结论贞清方可以通过抑制活性氧的产生来改善2型糖尿病大鼠的勃起功能障碍。

贞清方； 糖尿病； 勃起功能障碍； 活性氧

勃起功能障碍(erectile dysfunctions，ED)是指阴茎不能进行以及不能维持勃起以完成满意的性交。ED是糖尿病的一种常见并发症，在糖尿病患者中的患病率为25%～75%，且该比例随患者年龄和发病时间增加而增加[1-2]。高糖高脂是2型糖尿病的主要特征[2-5]，高糖和高脂通过抑制阴茎NO生成以及促进超氧化物生成而导致ED，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在ED的发病中起重要作用[6-10]。贞清方来自经典中药处方二至丸，包含墨旱莲、女贞子、薯蓣等3种中草药，目前用于治疗糖尿病肾病[3]。贞清方可以降低糖尿病性的高糖和高脂，同时有抑制脂质过氧化的作用[3，11]。本研究拟探索贞清方能否通过降低高糖和高脂以及ROS的生成来改善糖尿病性的ED。

1 材料与方法

1.1 贞清方提取制备

方法参照文献[3]。贞清方由女贞子、墨旱莲、薯蓣组成，这3种草药的比例为1.2∶1.2∶1.5 。3种草药混合，加水煎煮2 h，共煮2次，过滤，乙醇蒸发提纯，最终浓度为1.0 g/mL，提取液于4℃储存。

1.2 模型建立

30只SD雄性大鼠购于湖北省疾控中心实验动物中心，8周龄，体重180～220 g。经过1周的适应后，大鼠被随机分为3组：对照组(Con组，n=6)、糖尿病ED组(DM组，n=12)、糖尿病ED+贞清方治疗组(ZQR组，n=12)。Con组给予普通食物喂养，DM组和ZQR组均给予高糖高脂饮食喂养。4周后，DM组和ZQR组单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ，Sigma-Aldrich，美国)(30 mg/kg，溶解于枸橼酸缓冲液，pH值4.5)，对照组注射等量的枸橼酸缓冲液[3]。10周后使用阿扑吗啡(100 μg/kg，溶解于含0.1 g/L维生素C的生理盐水)筛选2型糖尿病ED大鼠。以大鼠阴茎头充血及阴茎体增长、露出作为勃起的标志，可伴或不伴有弯腰舔食阴茎、打哈欠及射精等动作，30 min内未出现阴茎勃起的大鼠，即为糖尿病ED大鼠[12]。ZQR组每天8：00～10：00贞清方提纯液4 g/(kg·d)灌胃，DM组和Con组给予等量生理盐水灌胃，共4周。灌胃剂量每周依据体重调整1次[3]。

1.3 勃起功能评估

腹腔注射0.4%戊巴比妥(35 mg/kg)麻醉大鼠，取仰卧位固定大鼠四肢和头部。取颈部正中切口，分离颈部肌群，游离左侧颈总动脉，丝线结扎远心端，动脉夹夹闭近心端，取“V”型切口，插入充满含肝素生理盐水(250 U/mL)的PE-50管，尾端连接压力换能器，监测平均动脉压(MAP)。腹部会阴取正中切口，于前列腺背外侧找到阴茎海绵体神经作为电刺激点，充分暴露阴茎海绵体，斜行穿刺插入充满含肝素生理盐水(250 U/mL)的PE-50管所带的25号针，尾端连接压力换能器，监测阴茎海绵体内压(ICP)。这二者连接到Powerlab工作平台(ADInstruments公司，澳大利亚)，平稳后使用双极电极丝，分别以2.5、5.0、7.5 V的电压，以频率15 Hz，波宽1.2 ms，持续1 min，间隔3 min方式电刺激海绵体神经，监测ICP/MAP的比值变化以评估大鼠的勃起功能。处死大鼠取阴茎海绵体标本，液氮速冻后储存于-80℃的冰箱中。

1.4 血糖及血脂的检测

大鼠海绵体测压结束后取颈动脉血4 mL，使用罗氏血糖仪测定葡萄糖，使用酶偶联比色法测定三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)。

1.5 Western blot检测

将阴茎海绵体组织剪碎后，加入RIPA裂解液(江苏碧云天生物公司)，并使用超声波破碎组织，离心取上清液，加入上样缓冲液后煮沸5 min，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离并转至PVDF膜；使用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h；分别使用抗内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和抗神经型一氧化氮合酶(nNOS)抗体(Abcam，英国)在4℃下孵育剪切好的PVDF膜过夜。洗膜后使用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h(Pierce，美国)；使用TBS洗膜后采用ECL化学发光试剂(Amersham，美国)显色、曝光，凝胶成像分析系统采集分析图像，以目的蛋白与β-actin的比值作为相对表达量。

1.6 氧化应激水平评估

取阴茎海绵体组织，制备组织匀浆，利用丙二醇(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测MDA水平，评估阴茎组织的脂质过氧化程度，从而分析组织的氧化应激水平。操作按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠的生长情况

筛选2型糖尿病ED大鼠后，3组大鼠分别给予贞清方提取物或生理盐水灌胃4周，各组大鼠生长情况均可。糖尿病大鼠造模成功19只，阴茎勃起功能障碍15只，其中DM组8只，ZQR组7只。DM组大鼠体重较Con组降低(P<0.05)，ZQR组大鼠体重较DM组大鼠体重增加(P<0.05)。见图1。

2.2 各组大鼠的代谢指标

血糖水平：DM组显著高于Con组(P<0.05)，ZQR组的血糖水平较DM组有显著降低(P<0.05)，见图2。血清TG、TC水平：DM组显著高于Con组(均P<0.05)，ZQR组的TG、TC水平较DM组有显著降低(均P<0.05)，见图3。

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图1 各组大鼠的体重Fig.1 Body weight of the rats in the three groups

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图2 各组大鼠血糖水平Fig.2 Blood glucose levels of the rats in the three groups

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图3 各组大鼠TG、TC水平Fig.3 TG and TC levels of the rats in the three groups

2.3 各组大鼠的勃起功能

分别用2.5、5.0和7.5 V电压刺激大鼠阴茎海绵体神经，分析maxICP/MAP后发现：DM组大鼠的maxICP/MAP与Con组相比显著下降(均P<0.05)，这充分说明了在DM组大鼠中存在勃起功能受损；与此同时，ZQR组大鼠的maxICP/MAP较DM组上升(均P<0.05)，说明ZQR组大鼠的勃起功能较DM组有明显的改善。见图4。

A：3组大鼠在2.5、5.0、7.5 V电压刺激下的MaxICP/MAP；B：3组大鼠在5 V电压刺激海绵体神经下的ICP变化曲线和即时MAP的变化曲线；与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图4 大鼠勃起功能评估Fig.4 Assessment of erectile function of the rats

2.4 各组大鼠阴茎海绵体中nNOS和eNOS的蛋白含量

Western blot检测结果显示：DM组大鼠与Con组相比，nNOS和eNOS蛋白表达明显降低(均P<0.05)，ZQR组则较DM组有所增加(均P<0.05)，见图5。

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图5 各组大鼠阴茎海绵体组织中eNOS和nNOS蛋白的Western blot检测结果Fig.5 Protein expression of eNOS and nNOS in rat penis detected by Western blotting

2.5 各组大鼠的氧化应激水平

通过检测脂质过氧化产物MDA的水平来评估海绵体组织中的氧化应激情况。DM组大鼠阴茎海绵体组织的MDA水平明显高于Con组(P<0.05)，ZQR组则较DM组有明显的降低(P<0.05)，见图6。

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05图6 各组大鼠阴茎海绵体组织中MDA水平Fig.6 MDA levels in rat penile tissue

3 讨论

本研究认为贞清方可以通过降低血脂和血糖，从而减少ROS的生成以及恢复eNOS和nNOS的表达，进而改善2型糖尿病ED。

高糖和高脂都与糖尿病ED相关。高糖诱导的线粒体氧自由基过剩是通过以下几个途径实现的：(1)糖酵解增加；(2)葡萄糖自氧化；(3)多元醇通路通量增加；(4)晚期糖化终产物(AGE)的形成增加；(5)蛋白激酶C(PKC)亚型激活；(6)己糖胺通路通量增加[13-14]。高脂导致海绵体组织的内皮依赖性舒张的损伤和过氧化物形成增加，高脂同样导致GMP循环形成障碍和后续的信号通路障碍[8]。本研究中DM组大鼠较Con组的血糖、TG、TC升高，这与先前的研究是一致的[3，11]。已有研究表明，贞清方的3个草药成分能改善葡萄糖和脂质的代谢。墨旱莲广泛应用于预防高脂血症和动脉粥样硬化[14]。薯蓣在地塞米松诱导的糖尿病大鼠中可以减少血液中的胰岛素和葡萄糖含量[15]。女贞子可以抑制由四氧嘧啶和肾上腺素诱导的小鼠血糖水平的升高[3]。本研究中糖尿病大鼠经过4周的贞清方治疗后，血糖水平显著降低，这与先前的研究一致[3，11]。与此同时，ZQR组还显著降低了血清TG、TC水平，这也提示了贞清方可能是通过抑制高糖和高脂来治疗糖尿病性ED。

阴茎勃起时海绵体平滑肌松弛，这是通过释放NO来完成的，这一过程中，NO激活鸟苷酸环化酶，产生更多的环磷鸟苷，环磷鸟苷作用于钙离子通道，使平滑肌松弛，允许血液进入阴茎动脉和海绵窦间隙从而形成阴茎的勃起。因此，这一过程中NO的减少会影响正常的勃起功能。在糖尿病模型中，已经有报道表明eNOS和nNOS的表达水平降低[7]。本研究发现贞清方可提高eNOS和nNOS的蛋白表达水平。有研究表明超氧化物阴离子与NO发生反应进而形成过氧硝基盐，这将导致NO的生物利用度下降。与此同时，过氧硝基盐是一种高毒性的分子，将导致细胞凋亡和造成阴茎的小动脉内皮细胞的损害。高浓度的过氧硝基盐会导致高水平的ROS的产生，并启动一连串的氧化还原反应从而引起细胞凋亡，造成对内皮细胞和神经元细胞的影响。并且内皮细胞和神经元细胞的凋亡和细胞毒性也会降低eNOS和nNOS的表达[16-17]。eNOS和nNOS是产生NO的主要来源，NO是产生和维持勃起的关键神经递质，eNOS和nNOS的降低势必会导致NO产生减少，NO的减少势必会导致ED的发生。所以ROS最终通过减少eNOS和nNOS的表达，进而损害勃起功能。贞清方能有效地阻止糖尿病大鼠阴茎海绵体中ROS的产生，并恢复eNOS和nNOS的表达，中断由糖尿病引发ED的恶性循环。

综上，贞清方可以通过降低糖尿病大鼠血糖和血脂，以及ROS的生成，进而增加eNOS和nNOS的表达，并且最终改善糖尿病大鼠的勃起功能。

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ZhenqingRecipeImprovesDiabeticErectileDysfunctionthroughSuppressingROSProductioninExperimentalType2DiabeticRats

Li Mingchao1，Lin Huang1，Guo Shuiming2etal

1DepartmentofUrology(InstituteofUrology)，2DepartmentofNephrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo investigate whether Zhenqing Recipe(ZQR)could ameliorate diabetes-related erectile dysfunction(ED)by reducing the reactive oxygen species(ROS)production.MethodsThirty 8-week-old healthy male SD rats were randomly divided into three groups：control group(group Con)，diabetic erectile dysfunction group(group DM)，and diabetic erectile dysfunction treated with Zhenqing Recipe group(group ZQR).Type 2 diabetic rat model was induced by intraperitoneal injection of small-dose streptozotocin after feeding with high glucose and high fat diets for four weeks.We screened out diabetic erectile dysfunction rats by apomorphine 10 weeks later.The course of treatment continued four weeks.And then blood glucose，triglyceride(TG)，cholesterol total(TC)，mean arterial pressure(MAP)，intracavernouspressure(ICP)，expression levels of nNOS and eNOS protein were measured by Western blotting.ResultsCompared with the control group，the levels of blood glucose and MDA were remarkably increased in diabetic rats.ZQR remarkably reduced levels of blood glucose and MDA of diabetic rats.Compared with the control group，the ratio of maximum ICP-to-MAP(maxICP/MAP)was significantly decreased in diabetic ED rats.ZQR improved erectile function of the diabetic ED rats.Expression levels of nNOS and eNOS protein were reduced as compared to those of control rats.ZQR significantly enhanced their expression levels in diabetic rats.ConclusionZQR can ameliorate type 2 diabetic ED by reducing the ROS production.

Zhenqing Recipe； diabetes mellitus； erectile dysfunction； reactive oxygen species

*国家自然科学基金资助项目(No.81300477)

李明超，男，1982年生，主治医师，医学博士，E-mail：chaoren149@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jhliu@tjh.tjmu.edu.cn(刘继红)；tjhwt@126.com(王涛)

R698.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.001

(2017-06-15 收稿)