配对盒4基因 R192S、R192H多态性与儿童青少年肥胖的研究

孔元梅 王春林 梁 黎 方燕兰 朱建芳

浙江大学医学院附属第一医院儿科（浙江杭州 310003）

配对盒4基因 R192S、R192H多态性与儿童青少年肥胖的研究

孔元梅 王春林 梁 黎 方燕兰 朱建芳

浙江大学医学院附属第一医院儿科（浙江杭州 310003）

目的 研究配对盒4（PAX4）基因 rs3824004（574C＞A；R192S）、rs2233580（575G＞A；R192H）多态性与儿童青少年肥胖及代谢指标的相关性。方法 随机选取103例肥胖儿童，平均年龄（10.82±2.57）岁，体质指数（BMI）（26.82±4.57）kg/m2；同期体检的100例正常体质量儿童为对照组，年龄（10.60±2.84）岁，BMI（16.79±2.13）kg/m2。测量并比较两组血压、体格指标以及血代谢指标。肥胖组儿童行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素释放试验，计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和总体胰岛素敏感指数（WBISI）。应用聚合酶链反应（PCR）检测PAX4 rs3824004、rs2233580多态性，分析多态位点的等位基因频率和基因型频率及组间差异，以及不同基因型与代谢指标的相关性。结果 肥胖组的身高、体质量、BMI、收缩压、舒张压、腰围、臀围、腰围身高比（WHtR）、空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）及天冬氨酸转氨酶（AST）均高于对照组，高密度脂蛋白（HDL）低于对照组；差异均有统计学意义（P＜0.05）。基因分布频率符合Hard-Weinberg平衡，rs3824004肥胖组和对照组的A等位基因频率分别为4.9%和5.0%，CA基因型频率分别为9.7%和10.0%；两组差异均无统计学意义（P＞0.05）。rs2233580肥胖组的GA基因型频率为25.2%，高于对照组（11.0%）；A等位基因频率为12.6%，也高于对照组（5.5%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。rs2233580 GA基因型的BMI及腰围高于GG基因型，差异均有统计学意义（P＜0.05），但logistic回归分析显示PAX4 rs2233580基因型与代谢指标并无相关性（P均＞0.05）。肥胖组PAX4 rs2233580不同基因型间HOMA-IR和WBISI差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论 PAX4 rs2233580影响BMI及腰围，可能参与儿童肥胖的发生，但不是儿童青少年肥胖发生的独立影响因素。

肥胖； 配对盒4基因； 儿童

儿童青少年肥胖日趋世界性流行，已被证明是糖尿病发病和死亡的风险预测因子[1]。肥胖是由多种遗传因素和环境因素共同作用所致，家系分析和双生子研究表明，遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作用，但单基因突变导致肥胖仅占肥胖患者的5%～7%，大部分肥胖是多基因病[2]。随着研究的深入，与肥胖相关的易感基因被不断发现。

配对盒4（PAX4）基因是配对同源结构转录因子PAX家族中的一员，定位于7q32.1，主要在胰岛β细胞中表达，在胰岛β细胞的生长、分化中发挥重要的调控作用[3,4]。PAX4基因突变会削弱其转录活性，从而影响胰岛β细胞的寿命或增殖。目前对PAX4的研究大多与糖尿病相关[5]，而且该基因上真正的致病或易感位点尚不完全清楚。在746例泰国的2型糖尿病（T2DM）患儿中发现PAX4 rs2233580基因型和等位基因频率显著高于对照组[6]，突变后影响胰岛β细胞的分化、增殖和凋亡，降低胰岛素活性。在对大样本的中国T2DM研究中发现，PAX4 rs2233580在亚洲T2DM中具有种族特异性[7]。本研究以中国肥胖儿童青少年为对象，采用病例-对照研究方法，分析PAX4 rs3824004、rs2233580突变情况以及与代谢指标的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2013年6月至2016年12月入住浙江大学医学院附属第一医院儿科的103例肥胖儿童青少年为研究对象。入组标准：①年龄≤16岁；②体质指数（BMI）＞同年龄、同性别第95百分位（P95）[8]；③剔除患有糖尿病及其他内分泌、遗传代谢、肾脏、内科急慢性疾病及使用调节血糖、血压、血脂等各种药物者。选择同期接受健康体检的100例性别、年龄与肥胖组相匹配的汉族儿童青少年为正常对照组， 其BMI处于同年龄、同性别P25～P75之间。

本研究均征得家长知情同意，研究方案经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.2 血压测量 取坐位由专人以台式血压计测量右臂肱动脉血压，间隔2 min，连测2次取平均值。

1.2.3 生化指标检测 于体格测量前日晚上清淡饮食，空腹10 小时以上，清晨8时抽取静脉血测空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平。

1.2.4 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素释放试验 肥胖组儿童测试前空腹10小时，测量当日清晨口服含1.75 g/kg无水葡萄糖的糖水（最大量不超过75 g），从饮第一口糖水开始计时，于30min、60min、90min和120min分别抽静脉血检测血糖和胰岛素。

1.2.5 稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和总体胰岛素敏感指数（WBISI）计算公式[9]为：HOMAIR=[空腹胰岛素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）]/22.5，WBISI=10 000/｛[空腹胰岛素（mIU/L）×空腹血糖（mg/dl）] ×[平均胰岛素（mIU/L）×平均血糖（mg/dl）]｝1/2。

1.2.6 基因型检测 抽取受检者外周血3 mL，EDTA抗凝，采用全血DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞基因组DNA进行聚合酶连反应。PCR扩增上游引物：5’-GCAGAGGCACTGGAGAAAG-3’，下游引物：5’-TACTTTATGCTGCCTGTCACC-3’，产物片段长度为828 bp。扩增体系为20 μL，含10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，基因组DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 u/μL）0.4 μL。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃总延伸5 min。扩增产物经电泳检测后，送至上海华大基因采用ABI3730测序仪进行测序。

1.3 统计学分析

精确掌握贫困地区基础设施、政策制度、劳力结构、经济发展能力等实情，精准填平补齐扶贫供给资源，改变扶贫资源规模偏小、资源总量偏少、资源质量偏低、资源结构不合理的病态。通过改革精准扶贫制度、完善扶贫机构、培养贫困人才、提高脱贫能力，构建多维度多层次精准扶贫保障体系，提高贫困地区供给侧效率和质量，保障精准识别、精准帮扶、精准管理扶贫对象，确保精准脱贫，助力精准扶贫。

应用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布并满足方差齐性数据，两组间比较采用t检验；TG、ALT、AST、HOMAIR、WBISI经对数转换符合正态分布，两组间均数比较采用t检验。计数资料以百分比或率表示，组间比较采用χ2检验。基因分布频率进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用logistic回归分析PAX4 rs2233580突变的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

肥胖组103例，男66例、女37例，平均年龄（10.82±2.57）岁，BMI（26.82±4.57）kg/m2。对照组100例，男67例、女33例，平均年龄（10.60±2.84）岁，BMI（16.79±2.13）kg/m2。两组间的性别比、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）；肥胖组的身高、体质量、BMI、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、腰围、臀围、腰围身高比（WHtR）、FPG、TC、LDL、TG、ALT及AST水平均高于对照组，而HDL低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 基因测序结果

PAX4第5外显子NCBI参照序列，第192位密码子为CGT，编码精氨酸（图1）。PAX4第5外显子rs3824004序列，第192位密码子从CGT→AGT，其所编码的精氨酸被丝氨酸取代，为错义点突变（图2）。PAX4第5外显子rs2233580序列，第192位密码子从CGT→CAT，其所编码的精氨酸被组氨酸取代，为错义点突变（图3）。

图1 PAX4第5外显子NCBI参照序列

图2 PAX4第5外显子rs3824004序列

图3 PAX4第5外显子rs2233580序列

2.3 基因分布频率的平衡性检验

rs3824004和rs2233580的基因分布频率差异均无统计学意义（χ2=0.55、2.04，P均＞0.05），基因期望值与观察值吻合较好，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.4 各组等位基因频率及基因型频率比较

rs3824004肥胖组和正常对照组的A等位基因频率分别为4.9%和5.0%，CA基因型频率分别为9.7%和10.0%，各组差异均无统计学意义（P均＞0.05）。rs2233580肥胖组的GA基因型频率为25.2%，高于正常对照组（11.0%）；rs2233580肥胖组的A等位基因频率为12.6%，也高于正常对照组（5.5%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 肥胖组和对照组一般情况

表1 肥胖组和对照组一般情况

项 目 肥胖组(n=103) 对照组(n=100) 统计量 P男/女(n) 66/37 67/33 χ2=0.19 0.661年龄/岁 10.82±2.57 10.60±2.84 t=0.26 0.564身高/cm 149.52±14.75 137.42±15.87 t=5.63 ＜0.001体质量/kg 61.98±21.37 32.56±10.21 t=12.58 ＜0.001 BMI/kg·m－2 26.82±4.57 16.79±2.13 t=20.15 ＜0.001 SBP/mmHg 117.51±9.75 106.05±7.92 t=9.00 ＜0.001 DBP/mmHg 69.43±8.42 65.31±9.49 t=3.19 0.002腰围/cm 88.32±11.92 58.60±8.00 t=20.11 ＜0.001臀围/cm 95.14±11.95 67.85±9.80 t=17.11 ＜0.001 WHtR 0.57±0.10 0.43±0.07 t=13.71 ＜0.001 FPG/mmol·L－1 5.33±0.68 5.11±0.43 t=2.70 0.008 TC/mmol·L－1 4.15±0.72 3.80±0.56 t=3.75 ＜0.001 HDL/mmol·L－1 1.28±0.32 1.45±0.25 t=4.34 ＜0.001 LDL/mmol·L－1 2.37±0.67 1.76±0.40 t=7.54 ＜0.001 TG/mmol·L－1 1.28±0.68 0.70±0.21 t=8.90 ＜0.001 ALT/mmol·L－1 42.77±55.29 10.87±4.22 t=10.23 ＜0.001 AST/mmol·L－1 32.08±29.20 21.64±4.50 t=4.21 ＜0.001

2.5 PAX4不同基因型间代谢指标相关性比较

rs3824004 CC和CA基因型的身高、体质量、BMI、SBP、DBP、腰围、臀围、WHtR、FPG、TC、HDL、LDL、TG、ALT及AST差异无统计学意义（P均＞0.05）。

rs2233580 GA基因型BMI（24.42 ±7.12) kg/m2显著高于GG基因型（21.31±5.81) kg/m2，差异有统计学意义（t=2.82，P=0.005）；GA基因型的腰围（86.30 ±11.11) cm也显著高于GG基因型（70.05±17.87) cm（t=6.78，P＜0.001）；GG和GA基因型的身高、体质量、SBP、DBP、臀围、WHtR、FPG、TC、HDL、LDL、TG、ALT及AST差异无统计学意义（P均＞0.05）。

进一步行logistic回归分析显示，rs2233580基因型与代谢指标无相关性（P均＞0.05）。

2.6 肥胖组PAX4 rs2233580不同基因型间胰岛素抵抗程度比较

肥胖组rs2233580 GA基因型HOMA-IR（6.29±3.78）和GG基因型HOMA-IR（6.71±4.90）差异无统计学意义（t=0.34，P=0.261）；GA基因型WBISI（2.08±1.33）和GG基因型WBISI（2.48±1.92）差异亦无统计学意义（t=1.73，P=0.073）。

3 讨论

随着经济发展以及生活水平的提高，我国儿童青少年肥胖症越来越受到社会和家庭的重视。据美国健康与营养调查数据（The National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES) 显示，2～19 岁儿童青少年的肥胖患病率为16.9%。流行病学调查数据表明，我国中小学生肥胖高达8.9%，并有逐年上升趋势[10,11]。营养摄入与吸收失衡、行为、环境和基因等因素均可导致肥胖发生。研究表明，5%左右的肥胖儿童存在复杂的多基因数量性状效应[12]。

PAX4是胰腺发育早期的必须转录抑制因子。近年来，越来越多的研究表明PAX4多态性与糖尿病的发生相关[13]。我们曾接诊1例12岁肥胖儿童，其母亲、舅舅及外婆均患有糖尿病，该患儿及其母亲、外婆糖尿病相关基因筛查结果显示，PAX4 5号外显子rs3824004突变，该位点突变目前国内外尚无与肥胖患者相关的报道。

rs3824004（574C＞A，R192S）与rs2233580（575G＞A，R192H）位于PAX4第5外显子相邻位置，编码同一个氨基酸（精氨酸），突变后分别引起由精氨酸到丝氨酸和组氨酸的突变。本研究发现rs3824004多态性频率在肥胖组和对照组比较无明显差异，而肥胖组rs2233580多态性频率较对照组显著升高，这与在T2DM患者中rs2233580多态性频率显著高于正常对照组相符[6,7]，也表明儿童青少年肥胖是糖尿病发病的风险预测因子。并且，GA基因型儿童的BMI及腰围显著高于GG基因型（P＜0.05），即575G＞A改变可以导致儿童青少年BMI和腰围增加，与肥胖的发生可能有关。但logistic回归分析显示，rs2233580基因型与肥胖代谢指标并无相关性，提示575G＞A改变可能参与儿童青少年肥胖的发生，但不是独立影响因素。

胰岛素抵抗是T2DM、肥胖症、高血压、高血脂的共同发病基础。本研究显示肥胖组PAX4 rs2233580不同基因型间HOMA-IR及WBISI无统计学差异，未能证实PAX4 rs2233580多态性与胰岛素抵抗相关。而相关研究显示，PAX4 rs2233580在T2DM患者对胰岛素敏感性降低中起重要作用[6]。本研究肥胖组样本量比较小（103例），尽管PAX4 rs2233580不同基因型间WBISI差异无统计学意义，但P为0.073，如进一步扩大样本量，可能差异会有统计学意义，尚需进一步的研究。

总之，本研究初步显示PAX4 rs2233580多态性与中国儿童青少年肥胖的发生有关，但与糖代谢、脂代谢以及胰岛素抵抗等是否相关，还有待进一步深入研究。

表2 肥胖组和对照组PAX4基因型频率及等位基因频率比较[n(%)]

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Association of PAX4 R192S and R192H polymorphism with obesity in children and adolescents

KONG Yuanmei,WANG Chunlin, LIANG Li, FANG Yanlan, ZHU Jianfang (Department of Pediatrics, The First Aff i liated Hospital of Zhejiang University Hangzhou, 310003, Zhejiang, China)

Objective To investigate association of the paired box 4 (PAX4) gene rs3824004 (574C＞A; R192S) and rs2233580 (575G＞A; R192H) polymorphism with obesity and metabolic markers in children and adolescents. Methods A total of 103 obese children were randomly selected, and an average age was (10.82±2.57) years, and body mass index (BMI)was (26.82±4.57) kg/m2. At the same period, 100 normal weight children were selected as the control group, and an average age of (10.60±2.84) years, and BMI was (16.79±2.13) kg/m2. The blood pressure, physical measurements, and blood metabolic parameters were measured and compared. The oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin release test were performed in the obesity group. The homeostasis model insulin resistance index (HOMA-IR) and the overall insulin sensitivity index (WBISI)were calculated. PAX4 rs3824004 and rs2233580 polymorphism were detected by PCR. The differences of allele frequency and genotype frequency of polymorphic loci were analyzed, and the correlation between different genotypes and metabolic indexes was analyzed. Results The height, weight, BMI, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, waist circumference,hip circumference, waist to height ratio (WHtR), fasting blood glucose (FPG), total cholesterol (TC), low density lipoprotein(LDL), triacylglycerol (TG), alanine aminotransferase (ALT), and aspartate aminotransferase (AST) in the obesity group were signif i cantly higher than those in the control group, and the high density lipoprotein (HDL) was signif i cantly lower than that in the control group (all P＜0.05). The frequency of gene distribution was in accordance with the Hard-Weinberg balance. Thefrequencies of A allele of rs3824004 in obesity and control groups were 4.9% and 5.0%, respectively, and the frequencies of CA genotype were 9.7% and 10.0%, respectively, and there was no signif i cant difference between two groups (P＞0.05). The frequency of GA allele of rs2233580 in obesity group was 25.2%, which was significantly higher than that in control group(P＜0.05). The BMI and waist in rs2233580 GA genotype were signif i cantly higher than those in GG genotype (all P ＜0.05).However, logistic regression analysis showed that there was no correlation between PAX4 rs2233580 genotype and metabolic markers (all P＞0.05). There were no significantly differences in HOMA-IR and WBISI among different genotypes of PAX4 rs2233580 in obesity group (all P＞0.05). Conclusions PAX4 rs2233580 affects children's BMI and waist circumference and may be involved in the development of childhood obesity, but it is not an independent risk factor for obesity in children and adolescents.

国家自然科学基金面上项目（No.11571309）；国家重点研发计划重大慢性非传染性疾病防控研究（No.2016YFC1305301）

王春林 电子信箱：e-mail：hzwangcl@zju.edu.cn

obesity; PAX4 gene; child

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.008

2017-07-14）

梁 华）