25羟基维生素D检测方法的可靠性分析

赵蓓蓓 程雅婷 董 衡 李卓阳 李冰玲 1. 广州医科大学金域检验学院；. 广州金域医学检验中心有限公司（广东广州 510005）

25羟基维生素D检测方法的可靠性分析

赵蓓蓓1,2程雅婷1,2董 衡2李卓阳2李冰玲21. 广州医科大学金域检验学院；2. 广州金域医学检验中心有限公司（广东广州 510005）

维生素D不仅在人体钙磷代谢和骨质钙化中起着重要作用，而且与2型糖尿病、乳腺癌、高血压等重大疾病有着密切关系[1,2]。然而，目前维生素D缺乏却是一个日益严重的全球性问题[3]，全球有近10亿人维生素D不足或缺乏[4]，中国上海有近三分之一的人维生素D不足[4,5]。维生素D缺乏将导致佝偻病、软骨病和骨质疏松等疾病，同时多项研究表明维生素D的营养水平若不能维持在最佳范围内，将会增加罹患糖尿病、高血压、乳腺癌等疾病的风险；而过量摄入维生素D者将会导致中毒，因此准确检测人体维生素D营养水平越来越受到重视。

在维生素D的体内代谢物中，25羟基维生素D（25OHD）由于其在血液中的浓度高且循环周期长而成为人体维生素D营养评估的最佳检测指标。维生素D主要有维生素D2和维生素D3两种存在形式，因此准确反映人体维生素D的营养水平，需同时检测血清25OHD2和25OHD3两项指标，以两者之和，即血清25OHD的总量来准确反映人体维生素D营养水平。目前25OHD的检测有多种分析技术和方法，按原理可分为色谱质谱法和免疫学法。不同的方法学间由于检测原理和检测系统的差异，在实际检测过程中可靠性存在明显差异[6]。

为了解决25OHD检测一致性的问题，2010年9月美国健康研究署膳食摄入部成立了维生素D标准化项目（Vitamin D Standardization Program，VDSP），其主要目的是通过对25OHD检测的标准化，促进维生素D缺乏和不足的检测、评估及补充治疗的标准化[7]。为了达到这一目的，VDSP在世界范围内建立了25OHD检测的参考方法系统。在这一系统中，美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和参考测量程序（Reference Measurement Procedures，RMPs）的结果被认为是真值。在真值的基础上成立了两类标准化机构，分别为美国疾病与预防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）成立的维生素D标准化项目（Vitamin D Standardization Certification Program，VDSCP）和基于准确度的定量保障项目（Accuracy-Based Quality Assurance Programs，ABQAP）。VDSCP由美国疾病与预防控制中心发起，主要针对25OHD检测试剂生产厂商和大型的第三方独立医学实验室，并将参加机构的25OHD检测结果与RMPs结果进行比较；ABQAP分别由美国病理学专家协会（College of American Pathologists，CAP）和英国维生素D定量保障机构（Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）分别发起，主要针对普通的医学检测实验室和研究实验室，并将参加机构的25OHD结果与NIST结果进行比较。

1 基于室间质量评价结果再分析不同检测方法的可靠性

据DEQAS报告显示，截止到2015年11月，已有来自53个国家超过2 100家实验室参加25OHD的室间质评项目，参与的检测方法种类超过26种[8，9]。其中上报参与评估的检测方法中，数量最多的4种方法依次是DiaSorin Liaison Total、IDS-iSYS、LC-MS/MS Method、Roche Total。使用LC-MS/MS 法的参评实验室超过150家[10]，而且使用LC-MS/MS 法参评的实验室有逐年增加的趋势。DEQAS针对25OHD项目所提供的室间质量评价（External Quality Assessment，EQA）样本基质，来源于接受放血治疗的血色病或红细胞增多症患者（采血经过患者知情同意，经过当地伦理委员会和英国卫生部批准）；为了研究基质效应、基质干扰等因素，对不同方法学检测结果的影响，DEQAS会选择性地在某些EQA样本中，加入某些干扰物质。同时，DEQAS自2013年4月开始，在其提供的报告中会体现NIST的结果供参评实验室进行全面评估。

DEQAS通过汇总25OHD室间质量评价结果[8-10]，再分析后得出如下结果：①在EQA样本中总25OHD浓度相近的情况下，大部分免疫学方法对中度脂血样本（三甘油酸酯的浓度为4.0 mmol/L）的检测结果与NIST结果相比，会有明显的负偏倚。相对免疫学方法而言，HPLC和LC-MS/MS法的结果与NIST结果偏倚较小。免疫学方法的中度脂血样本检测结果与NIST结果的差异性，与同批次其他样本结果的变异度相比，多无显著变化，但Abbott，Diasorin Liaison法除外。②在EQA样本中总25OHD的浓度相近，但含有较高比例25OHD2的（27%，22.3 nmol/L）样本中，免疫学方法的检测结果与NIST结果相比存在负偏倚，这一偏倚情况，在Abbott，Diasorin RIA， Diasorin Liaison法中，尤其明显。这可能是由于这些系统对25OHD2检测的特异性不够导致的。③在EQA样本中总25OHD浓度较高的情况下，大部分免疫学方法的结果与NIST结果相比会有明显的正偏倚，且同种免疫学方法不同实验室间的结果变异性较大。分析原因可能与较高25OHD浓度样本，一般含有较高浓度的24,25(OH)2D有关。24,25(OH)2D在配体结合分析中会对25OHD检测造成严重的交叉反应，使检测结果出现正偏倚。当然这一结论，DEQAS认为有待持续准确地分析24,25(OH)2D的检测结果后，进一步证实。④从同种方法学的25OHD检测结果均值与NIST结果的偏倚情况看，HPLC和LC-MS/MS法的结果偏倚在－10%～15%范围内波动，而大部分的免疫学方法的结果偏倚在－30%～40%范围内波动，反映出免疫学方法的室间变异性明显大于色谱质谱法。

据CAP的结果报告显示，截止到2015年共有超过400家实验室参加CAP的ABVD（Accuracy-Based Vitamin D）项目[11]。此项目提供来自于美国CDC的参考值。参评的实验室中，使用免疫学方法如Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas、Siemens Diagnostics等的实验室约占80%，分别为16.1%、15.1%、15.9%、22.5%；使用LC-MS/MS法的实验室占19.3%（60余家），且亦有逐年增加的趋势。CAP自2013－2014年总共提供了12个室间质评样本，并从2015年开始重新提供了这12个室间质评样本，同时在之前提供25OHD3、25OHD2的美国CDC参考值的基础上，增加了3epi-25OHD3的结果。CAP所提供的25OHD项目的EQA样本基质，来源于数个捐献者的新鲜冰冻血清，部分捐献者抽血前服用维生素D2（采血经过伦理委员会批准）。

CAP通过汇总室间质量报告[11-12]得出如下结果：①不同的检测方法结果均值与美国CDC的参考值相比，偏倚有明显的差异，但总体而言LC-MS/MS法结果的偏倚最小，且不同EQA标本间的偏倚变化也最小。②含有25OHD2的EQA样本检测结果，与美国CDC参考值的偏倚，高于不含25OHD2的EQA样本的结果偏倚，这一变化在Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas法中体现的尤为明显。

2 基于44例体检者样品的不同检测方法25OHD结果可靠性分析

随机选取2014年7月至2015年2月期间，在广州金域体检中心进行体检的44例健康体检者，抽取全血各1.0 mL，置于－4℃保存。将同一体检者的血清样品，在同一天内，分别采用LC-MS/MS法和Roche、Siemens两种免疫学方法，进行检测及比对分析。其中本实验室的LC-MS/MS法经过了严格的方法学验证，并参与了DEQAS和CAP的EQA项目。

44份血清样品检测所用的仪器和试剂：API4000液相色谱串联质谱仪（美国Sciex公司）；Cobas e601全自动免疫分析仪（罗氏公司）； ADVIA Centaur XP全自动免疫分析仪（西门子公司）；Milli-Q Gradient 超纯水机；雅培25羟基维生素D检测试剂盒；罗氏总25羟基维生素D检测试剂盒；甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯，购自德国默克公司；25OHD2和25OHD3标准品均购自西格玛中国有限公司。

在收集体检者样本周期内，LC-MS/MS方法EQA结果与对应机构提供的参考结果的分析数据见表1和2。本实验室采用LC-MS/MS法检测的25OHD结果与NIST和CDC结果偏倚在10%以内，说明所用LC-MS/MS方法的准确度较好。

44份血清样品基于本实验室3种检测方法所得的检测数据及偏倚分析情况见表3、图1。图1中圆圈标识的是样品中25OHD2的浓度＞10 ng/mL的检测结果。由图1可知，Roche和Siemens法的检测结果与LC-MS/MS法的差异较大，且不同的样本基质结果之间差异没有规律可循，偏倚在－60%～30%不等。这一结果与DEQAS的结果“大部分的免疫学方法的结果与NIST结果相比偏倚在－30%～40%范围内波动”相吻合；但在实际样品检测中，这一偏倚的波动范围更大。结合表2和图1，Siemens的结果整体波动性比Roche要大，且在大多数样本中，呈现出比Roche结果偏倚更大的趋势。图1圆圈标识的含有较高25OHD2的样品的检测结果，与LC-MS/MS法相比，偏倚并没有呈现出更大的趋势。这一结果与DEQAS和CAP的结论中25OHD2含量增加时，免疫学法结果与参考值偏倚更大的情况不相符。这可能是由于在实际样品检测过程中，不同样本基质对免疫学法造成的影响，远大于25OHD2浓度增高所带来的影响所致。而这一情况的存在，当连续进行25OHD治疗的患者的血清基质发生较大变化时，免疫学法可能无法正确反映治疗方案的真实情况。

表 1 本实验室LC-MS/MS法25OHD结果与NIST结果比较分析

表 2 本实验室LC-MS/MS方法25OHD结果与CDC结果比较分析

图1 基于临床患者25OHD结果的Roche、Siemens与LC-MS/MS法的偏倚分析

表 3 44例体检者标本分别采用LC-MS/MS和Roce、Simens法检测25OHD的结果比较分析

结合图1和图2综合分析，Roche和Siemens法与LC-MS/MS方法的偏倚波动范围在检测实际样品时，远大于在EQA样本检测中的波动范围。这可能是由于EQA结果是基于多家实验室均值的比较，在一定程度上减弱了室间差异和基质差异带来的变异。同时从检测结果可以看出，Roche和Siemens法与LC-MS/MS方法相比，结果变异性随基质的不同差异较大，尤其是Siemens法的偏倚在很多样品中超过25%，甚至达到55%以上，这表明这两种方法在部分样本品检测中，准确度可能达不到要求。

图2 基于EQA结果的Roche、Siemens与LC-MS/MS法的偏倚分析

由于所选取的44份样品未有脂血状况，所以未能验证DEQAS关于大部分免疫学方法对中度脂血样结果偏低的结论；且本次LC-MS/MS法未能同时检测24,25(OH)2D的结果，所以也未能反映和评估DEQAS关于在总 25OHD较高时，大部分免疫学方法样本结果偏高的结论。同时随机抽取的44例体检者样品的25OHD在29.4～65.2 ng/mL之间，基本落在25OHD的最佳浓度水平范围内，没有覆盖临床较低浓度和较高浓度，因此研究结论可能存在一定的局限性。

综上所述，在检测血清25OHD时，采用免疫学方法，可能受基质和25OHD体内代谢物的影响较大，这一影响会因样品基质的复杂性而放大，且可能存在对某些样品检测的准确度不够的情况。而LC-MS/MS方法较免疫学方法，与NIST结果和CDC参考值的偏倚较小，且受基质和25OHD内源性待测物的影响较小，因此可靠性更好。

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2016年广州市科技计划项目(201604020091)

李冰玲 电子信箱：libingling@Kingmed.com.cn

2017-07-03）

邹 强）