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25羟基维生素D检测方法的可靠性分析

2018-01-03赵蓓蓓程雅婷李卓阳李冰玲广州医科大学金域检验学院广州金域医学检验中心有限公司广东广州510005

临床儿科杂志 2017年12期
关键词:免疫学基质维生素

赵蓓蓓 程雅婷 董 衡 李卓阳 李冰玲 1. 广州医科大学金域检验学院;. 广州金域医学检验中心有限公司(广东广州 510005)

25羟基维生素D检测方法的可靠性分析

赵蓓蓓1,2程雅婷1,2董 衡2李卓阳2李冰玲21. 广州医科大学金域检验学院;2. 广州金域医学检验中心有限公司(广东广州 510005)

维生素D不仅在人体钙磷代谢和骨质钙化中起着重要作用,而且与2型糖尿病、乳腺癌、高血压等重大疾病有着密切关系[1,2]。然而,目前维生素D缺乏却是一个日益严重的全球性问题[3],全球有近10亿人维生素D不足或缺乏[4],中国上海有近三分之一的人维生素D不足[4,5]。维生素D缺乏将导致佝偻病、软骨病和骨质疏松等疾病,同时多项研究表明维生素D的营养水平若不能维持在最佳范围内,将会增加罹患糖尿病、高血压、乳腺癌等疾病的风险;而过量摄入维生素D者将会导致中毒,因此准确检测人体维生素D营养水平越来越受到重视。

在维生素D的体内代谢物中,25羟基维生素D(25OHD)由于其在血液中的浓度高且循环周期长而成为人体维生素D营养评估的最佳检测指标。维生素D主要有维生素D2和维生素D3两种存在形式,因此准确反映人体维生素D的营养水平,需同时检测血清25OHD2和25OHD3两项指标,以两者之和,即血清25OHD的总量来准确反映人体维生素D营养水平。目前25OHD的检测有多种分析技术和方法,按原理可分为色谱质谱法和免疫学法。不同的方法学间由于检测原理和检测系统的差异,在实际检测过程中可靠性存在明显差异[6]。

为了解决25OHD检测一致性的问题,2010年9月美国健康研究署膳食摄入部成立了维生素D标准化项目(Vitamin D Standardization Program,VDSP),其主要目的是通过对25OHD检测的标准化,促进维生素D缺乏和不足的检测、评估及补充治疗的标准化[7]。为了达到这一目的,VDSP在世界范围内建立了25OHD检测的参考方法系统。在这一系统中,美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)和参考测量程序(Reference Measurement Procedures,RMPs)的结果被认为是真值。在真值的基础上成立了两类标准化机构,分别为美国疾病与预防控制中心(Centers for Disease Control,CDC)成立的维生素D标准化项目(Vitamin D Standardization Certification Program,VDSCP)和基于准确度的定量保障项目(Accuracy-Based Quality Assurance Programs,ABQAP)。VDSCP由美国疾病与预防控制中心发起,主要针对25OHD检测试剂生产厂商和大型的第三方独立医学实验室,并将参加机构的25OHD检测结果与RMPs结果进行比较;ABQAP分别由美国病理学专家协会(College of American Pathologists,CAP)和英国维生素D定量保障机构(Vitamin D External Quality Assessment Scheme,DEQAS)分别发起,主要针对普通的医学检测实验室和研究实验室,并将参加机构的25OHD结果与NIST结果进行比较。

1 基于室间质量评价结果再分析不同检测方法的可靠性

据DEQAS报告显示,截止到2015年11月,已有来自53个国家超过2 100家实验室参加25OHD的室间质评项目,参与的检测方法种类超过26种[8,9]。其中上报参与评估的检测方法中,数量最多的4种方法依次是DiaSorin Liaison Total、IDS-iSYS、LC-MS/MS Method、Roche Total。使用LC-MS/MS 法的参评实验室超过150家[10],而且使用LC-MS/MS 法参评的实验室有逐年增加的趋势。DEQAS针对25OHD项目所提供的室间质量评价(External Quality Assessment,EQA)样本基质,来源于接受放血治疗的血色病或红细胞增多症患者(采血经过患者知情同意,经过当地伦理委员会和英国卫生部批准);为了研究基质效应、基质干扰等因素,对不同方法学检测结果的影响,DEQAS会选择性地在某些EQA样本中,加入某些干扰物质。同时,DEQAS自2013年4月开始,在其提供的报告中会体现NIST的结果供参评实验室进行全面评估。

DEQAS通过汇总25OHD室间质量评价结果[8-10],再分析后得出如下结果:①在EQA样本中总25OHD浓度相近的情况下,大部分免疫学方法对中度脂血样本(三甘油酸酯的浓度为4.0 mmol/L)的检测结果与NIST结果相比,会有明显的负偏倚。相对免疫学方法而言,HPLC和LC-MS/MS法的结果与NIST结果偏倚较小。免疫学方法的中度脂血样本检测结果与NIST结果的差异性,与同批次其他样本结果的变异度相比,多无显著变化,但Abbott,Diasorin Liaison法除外。②在EQA样本中总25OHD的浓度相近,但含有较高比例25OHD2的(27%,22.3 nmol/L)样本中,免疫学方法的检测结果与NIST结果相比存在负偏倚,这一偏倚情况,在Abbott,Diasorin RIA, Diasorin Liaison法中,尤其明显。这可能是由于这些系统对25OHD2检测的特异性不够导致的。③在EQA样本中总25OHD浓度较高的情况下,大部分免疫学方法的结果与NIST结果相比会有明显的正偏倚,且同种免疫学方法不同实验室间的结果变异性较大。分析原因可能与较高25OHD浓度样本,一般含有较高浓度的24,25(OH)2D有关。24,25(OH)2D在配体结合分析中会对25OHD检测造成严重的交叉反应,使检测结果出现正偏倚。当然这一结论,DEQAS认为有待持续准确地分析24,25(OH)2D的检测结果后,进一步证实。④从同种方法学的25OHD检测结果均值与NIST结果的偏倚情况看,HPLC和LC-MS/MS法的结果偏倚在-10%~15%范围内波动,而大部分的免疫学方法的结果偏倚在-30%~40%范围内波动,反映出免疫学方法的室间变异性明显大于色谱质谱法。

据CAP的结果报告显示,截止到2015年共有超过400家实验室参加CAP的ABVD(Accuracy-Based Vitamin D)项目[11]。此项目提供来自于美国CDC的参考值。参评的实验室中,使用免疫学方法如Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas、Siemens Diagnostics等的实验室约占80%,分别为16.1%、15.1%、15.9%、22.5%;使用LC-MS/MS法的实验室占19.3%(60余家),且亦有逐年增加的趋势。CAP自2013-2014年总共提供了12个室间质评样本,并从2015年开始重新提供了这12个室间质评样本,同时在之前提供25OHD3、25OHD2的美国CDC参考值的基础上,增加了3epi-25OHD3的结果。CAP所提供的25OHD项目的EQA样本基质,来源于数个捐献者的新鲜冰冻血清,部分捐献者抽血前服用维生素D2(采血经过伦理委员会批准)。

CAP通过汇总室间质量报告[11-12]得出如下结果:①不同的检测方法结果均值与美国CDC的参考值相比,偏倚有明显的差异,但总体而言LC-MS/MS法结果的偏倚最小,且不同EQA标本间的偏倚变化也最小。②含有25OHD2的EQA样本检测结果,与美国CDC参考值的偏倚,高于不含25OHD2的EQA样本的结果偏倚,这一变化在Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas法中体现的尤为明显。

2 基于44例体检者样品的不同检测方法25OHD结果可靠性分析

随机选取2014年7月至2015年2月期间,在广州金域体检中心进行体检的44例健康体检者,抽取全血各1.0 mL,置于-4℃保存。将同一体检者的血清样品,在同一天内,分别采用LC-MS/MS法和Roche、Siemens两种免疫学方法,进行检测及比对分析。其中本实验室的LC-MS/MS法经过了严格的方法学验证,并参与了DEQAS和CAP的EQA项目。

44份血清样品检测所用的仪器和试剂:API4000液相色谱串联质谱仪(美国Sciex公司);Cobas e601全自动免疫分析仪(罗氏公司); ADVIA Centaur XP全自动免疫分析仪(西门子公司);Milli-Q Gradient 超纯水机;雅培25羟基维生素D检测试剂盒;罗氏总25羟基维生素D检测试剂盒;甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯,购自德国默克公司;25OHD2和25OHD3标准品均购自西格玛中国有限公司。

在收集体检者样本周期内,LC-MS/MS方法EQA结果与对应机构提供的参考结果的分析数据见表1和2。本实验室采用LC-MS/MS法检测的25OHD结果与NIST和CDC结果偏倚在10%以内,说明所用LC-MS/MS方法的准确度较好。

44份血清样品基于本实验室3种检测方法所得的检测数据及偏倚分析情况见表3、图1。图1中圆圈标识的是样品中25OHD2的浓度>10 ng/mL的检测结果。由图1可知,Roche和Siemens法的检测结果与LC-MS/MS法的差异较大,且不同的样本基质结果之间差异没有规律可循,偏倚在-60%~30%不等。这一结果与DEQAS的结果“大部分的免疫学方法的结果与NIST结果相比偏倚在-30%~40%范围内波动”相吻合;但在实际样品检测中,这一偏倚的波动范围更大。结合表2和图1,Siemens的结果整体波动性比Roche要大,且在大多数样本中,呈现出比Roche结果偏倚更大的趋势。图1圆圈标识的含有较高25OHD2的样品的检测结果,与LC-MS/MS法相比,偏倚并没有呈现出更大的趋势。这一结果与DEQAS和CAP的结论中25OHD2含量增加时,免疫学法结果与参考值偏倚更大的情况不相符。这可能是由于在实际样品检测过程中,不同样本基质对免疫学法造成的影响,远大于25OHD2浓度增高所带来的影响所致。而这一情况的存在,当连续进行25OHD治疗的患者的血清基质发生较大变化时,免疫学法可能无法正确反映治疗方案的真实情况。

表 1 本实验室LC-MS/MS法25OHD结果与NIST结果比较分析

表 2 本实验室LC-MS/MS方法25OHD结果与CDC结果比较分析

图1 基于临床患者25OHD结果的Roche、Siemens与LC-MS/MS法的偏倚分析

表 3 44例体检者标本分别采用LC-MS/MS和Roce、Simens法检测25OHD的结果比较分析

结合图1和图2综合分析,Roche和Siemens法与LC-MS/MS方法的偏倚波动范围在检测实际样品时,远大于在EQA样本检测中的波动范围。这可能是由于EQA结果是基于多家实验室均值的比较,在一定程度上减弱了室间差异和基质差异带来的变异。同时从检测结果可以看出,Roche和Siemens法与LC-MS/MS方法相比,结果变异性随基质的不同差异较大,尤其是Siemens法的偏倚在很多样品中超过25%,甚至达到55%以上,这表明这两种方法在部分样本品检测中,准确度可能达不到要求。

图2 基于EQA结果的Roche、Siemens与LC-MS/MS法的偏倚分析

由于所选取的44份样品未有脂血状况,所以未能验证DEQAS关于大部分免疫学方法对中度脂血样结果偏低的结论;且本次LC-MS/MS法未能同时检测24,25(OH)2D的结果,所以也未能反映和评估DEQAS关于在总 25OHD较高时,大部分免疫学方法样本结果偏高的结论。同时随机抽取的44例体检者样品的25OHD在29.4~65.2 ng/mL之间,基本落在25OHD的最佳浓度水平范围内,没有覆盖临床较低浓度和较高浓度,因此研究结论可能存在一定的局限性。

综上所述,在检测血清25OHD时,采用免疫学方法,可能受基质和25OHD体内代谢物的影响较大,这一影响会因样品基质的复杂性而放大,且可能存在对某些样品检测的准确度不够的情况。而LC-MS/MS方法较免疫学方法,与NIST结果和CDC参考值的偏倚较小,且受基质和25OHD内源性待测物的影响较小,因此可靠性更好。

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[10] DEQAS. DEQAS 25 Hydroxyvitamin D method means for major method groups October 2015-Laboratory 1627 [Z].America: DEQAS, 2015.

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[12] CAP. ABVD-A 2015 accuracy-based vitamin D original evaluation [Z]. America: CAP, 2015.

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.020

2016年广州市科技计划项目(201604020091)

李冰玲 电子信箱:libingling@Kingmed.com.cn

2017-07-03)

邹 强)

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