一株驴源干酪乳杆菌分离、鉴定及生物学特性研究

刘宇 ，尹珺伊 ，江波涛 ，史同瑞 ，徐伟生 ，杨文忠 ，李阳 ，陈楠楠 ，秦平伟 ，侯美如 ，王岩 ，朱战波

（1.黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省三头驴农业科技有限公司；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

一株驴源干酪乳杆菌分离、鉴定及生物学特性研究

刘宇1，2，尹珺伊1，江波涛1，2，史同瑞1，徐伟生2，杨文忠2，李阳1，陈楠楠1，秦平伟1，侯美如1，王岩1，朱战波3

（1.黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省三头驴农业科技有限公司；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

为了分离出可用于研发驴用微生态制剂的乳酸杆菌，采集健康驴新鲜粪样4份，通过分离培养、形态特征、培养特性筛选出革兰氏阳性，厌氧，无芽孢杆菌1株。通过生理生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离菌株为干酪乳杆菌，编号为LV1。生物学特性研究结果表明，干酪乳杆菌LV1安全，无致病性，适宜生长温度范围为30～40℃，培养液初始pH3～8条件下均能生长。研究为研发驴用乳酸杆菌微生态制剂奠定了基础。

牛驴；干酪乳酸杆菌；生物学特性

驴是草食家畜，饲草为主要日粮[1]，饲喂量不足或饲喂质量较差的饲草将影响驴消化系统功能、机体健康和生产性能，制约驴养殖业发展[2]。

乳酸杆菌（Lactic acid bacteria，LAB）是动物肠道中的优势菌群和常在菌群，可发酵产生大量有机酸、消化酶、维生素、抑菌物质等代谢产物[3，4]，调节菌群平衡，增强免疫力[5]。通过乳酸杆菌的发酵作用，将富含粗纤维的农作物秸秆，转变为优质的驴用生物发酵粗饲料，替代饲草粗饲料，在提高驴生产性能同时缓解饲草缺乏压力，促进生物质资源利用[6]。

研究拟从健康驴肠道内分离乳酸杆菌，研究其生物学特性，为研发驴用微生态制剂和驴用生态饲料，促进驴养殖业发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

前往黑龙江省三头驴农业科技有限公司种驴繁育基地，无菌采集健康驴新鲜粪便4份，冷藏并迅速送实验室进行细菌分离。

1.1.2 培养基

MRS肉汤和MRS琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司，用于乳酸杆菌分离培养。

1.1.3 主要试剂

细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司，细菌DNA提取试剂盒、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将无菌采集的健康驴新鲜粪样置于盛有50 mL灭菌生理盐水含玻璃珠的锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床，180 r·min-1振荡 5 min，然后进行 10倍系列稀释，自10-1至10-9，共9个稀释度。

1.2.2 菌株分离、染色和镜检

分别取适宜稀释度的粪样混悬液0.1 mL涂布于MRS平板，37℃恒温厌氧培养24～48 h。挑取各种不同菌落进行革兰氏染色，镜检，观察菌体形态。

1.2.3 菌株的纯化

挑取MRS琼脂培养基平板上的疑似菌落进行纯化，纯化好的菌株进行菌落形态观察，并描述各菌株的菌落形态特征。

1.2.4 乳酸杆菌生化鉴定

依据《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《乳酸细菌的分类鉴定及实验方法》[8]中乳酸杆菌属和种的生理生化鉴定指标，首先通过厌氧生长试验、运动性试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，吲哚试验，初步确定乳酸杆菌属。再通过糖醇类发酵产酸试验，包括葡萄糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、松三糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖酸盐、甘露醇、山梨醇、七叶苷、水杨素等，以确定乳酸杆菌种。

1.2.5 乳酸杆菌PCR鉴定

提取菌株LV1基因组DNA，采用干酪乳杆菌16S rDNA 鉴定引物[9]，上游引物 P1：5’-TGGTCGGC AGAGTAACTGTTGTCG-3’，下游引物 P2：5’-CCAC CTTCCTCCGGTTTGTCA-3’，扩增片段大小为727 bp，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系（25 μL）：PCR Premix 12.5 μL，P1、P2 各 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火复性40 s，72℃延伸2 min，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析仪观察结果。

1.2.6 生物学特性研究

1.2.6.1 菌株生长曲线测定

取菌株LV1 24～48 h培养液，以1%接种量（约2.0×106CFU·mL-1）接种MRS肉汤，置37℃厌氧培养，每隔2 h取样，于波长620 nm处测定不同培养时间菌株培养液的OD值。以无菌MRS肉汤作空白对照，以培养时间为横坐标，OD620值为纵坐标，绘制生长曲线图，试验设3个重复。

1.2.6.2 培养温度对菌株生长的影响

取菌株LV1 24～48 h培养液，以1%接种量（约2.0×106CFU·mL-1） 接种 MRS 肉汤，分别置 20、25、30、35、40、45、50、55 ℃条件下厌氧培养 18 h，以无菌MRS肉汤作空白对照，于波长620 nm处测定各培养温度下菌株培养液的OD值。以培养温度为横坐标，OD620值为纵坐标，绘制曲线图，比较菌株生长情况，试验设3个重复。

1.2.6.3 培养液pH对菌株生长的影响

取菌株LV1 24～48 h培养液，以1%接种量（约2.0×106CFU·mL-1）接种 MRS 肉汤，pH 值分别调整为2、3、4、5、6、7、8、9，置 37 ℃厌氧培养 18 h，于波长620 nm处测定各pH条件下菌株培养液的OD值。以无菌MRS作空白对照，以pH为横坐标，OD620值为纵坐标，绘制曲线图，比较菌株生长情况，试验设3个重复。

1.2.6.4 安全性试验

将80只小白鼠随机分为高剂量组（3×1011CFU·kg-1bw）、中剂量组（2×1011CFU·kg-1bw）、低剂量组（1×1011CFU·kg-1bw）和生理盐水对照组，每组20只，雌雄各半。在灌服试验菌前8 h至灌服后4 h禁食，但不禁水。取纯化菌接种营养肉汤，37℃厌氧培养 24～48 h，4 000 r·min-1离心 15 min，弃上清，用生理盐水调整菌数，各组均一次性灌服。灌服后每天观察，并记录小白鼠临床表现，死亡鼠剖检，观察14 d后处死存活小鼠，剖检，出现异常变化的器官制作组织切片。

2 结果

2.1 形态特征

通过厌氧分离纯化，得到革兰氏阳性、短杆状、两端钝圆、成链，无芽孢杆菌1株，菌株编号为LV1，菌落特性为圆形、中等大小、边缘整齐、表面光滑、乳白色菌落，菌落直径1.0～2.0 mm。

2.2 生化鉴定结果

2.2.1 乳酸杆菌属的生化鉴定结果

厌氧生长试验阳性，运动性试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，吲哚试验等均为阴性，初步确定分离株LV1为乳酸杆菌属。

2.2.2 乳酸杆菌种的生化鉴定结果

研究共应用了15种糖醇微量生化反应管。其中，葡萄糖、纤维二塘、乳糖、麦芽糖、松三糖、核糖、蔗糖、葡萄糖酸盐、山梨醇、七叶苷、水杨素等均为阳性，阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、甘露醇等均为阴性，符合干酪乳杆菌生化特征，确定分离株LV1为干酪乳杆菌。

2.3 PCR鉴定结果

凝胶成像结果表明，分离株LV1在727 bp处出现特异性扩增条带，确定LV1为干酪乳杆菌，与生化鉴定结果相符，PCR扩增结果见图1。

图1 目的基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of target gene

2.4 生物学特性结果

2.4.1 菌株生长曲线

菌株LV1在 0～4 h为生长延迟期，4～12 h进入对数生长期，OD620 为 1.041，12～24 h 为稳定期，24 h以后进入衰亡期。。

2.4.2 培养温度对菌株生长的影响

试验结果表明，菌株LV1在培养温度为25～45℃均能生长，其中适宜生长温度为30～40℃，最适生长温度为35～37℃，具体结果见图2。

图2 培养温度对菌株LV1生长的影响Fig.2 Effect of temperature on the growth of strain LV1

2.4.3 培养液pH对菌株生长的影响

试验结果表明，菌株LV1在培养液初始pH3～8条件下均能生长，其中适宜pH为5～7，最适pH为6～7，具体结果见图 3。

图3 培养液pH对菌株LV1生长的影响Fig.3 Effect of pH on the growth of strain LV1

2.4.4 安全性试验结果

试验组和对照组小鼠的精神、食欲、行为、粪便等均未见异常，试验鼠未出现死亡。观察14 d后处死存活小鼠，剖检内脏器官均未见异常变化，实验结果表明干酪乳杆菌LV1安全。

3 讨论

诸多动物源乳酸杆菌已被分离，益生作用得到广泛证实[10-12]，而驴源乳酸杆菌的分离及生物学特性研究尚未见报道，研究首次从健康驴新鲜粪便中分离到干酪乳杆菌1株，编号为LV1，对其生物学特性进行了研究，为研发驴用乳酸杆菌微生态制剂奠定了基础。

驴源干酪乳杆菌LV1，安全，无致病性，可用于饲用微生态制剂的研发。适宜生长温度和pH范围广，在25～30℃的低温发酵环境中均可生长，适用于寒地低温环境发酵。此外，该菌株具有耐酸特性，在pH3.0条件下仍可生长。上述良好的生物学特性表明，干酪乳杆菌LV1在研发驴用乳酸杆菌微生态制剂方面具有广阔前景。

目前，在驴微生态研发领域仍缺乏系统、科学的研究[13-14]。研究从驴肠道微生态、动物营养、生物质资源利用角度出发，分离、鉴定了驴源肠道乳酸杆菌，研究其生物学特性，为下一步研究驴用生态制剂产品奠定了基础。推动驴传统养殖模式向高效、绿色、无公害、环保的生态养殖模式转变，促进我国驴养殖业的健康、循环、可持续发展。

［1］ 李昊，罗土炎，严晟旻，等.源于驴血清白蛋白的肽促进骨髓造血细胞增殖的试验研究［J］.中国食品学报，2010，10（2）：12-19.

［2］ 李青叶.驴血清蛋白酶解物生产工艺的优化及活性初步研究［D］.福州：福州大学，2014.

［3］ Liu Y，Li Y，Shi T，et al.The optimization of spray drying process of Lactobacillus reuteri［J］.LWT-Food Science and Technology，2016，68：615-618.

［4］ 刘宇，李阳，刘通，等.乳酸菌益生特性及在猪生产中应用研究进展［J］.动物医学进展，2016，37（6）：87-90.

［5］ 张军，刘宇，朱战波，等.猪用复合微生态制剂制备及保存期内活菌数研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）：63-65.

［6］ 赛力克·库鲁西，努尔别克·哈木巴太，努尔兰·木合买提，等.肉驴生产价值与肉驴养殖技术［J］.新疆畜牧业，2011（11）：48-50.

［7］ 谢凤珍，华承伟，牛宏阳.耐热木聚糖酶源细菌筛选尧鉴定及酶学性质［J］.河南科技学院学报，2014，42（5）：7-10.

［8］ 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［9］ 刘宇.猪用乳酸杆菌、双歧杆菌、纳豆芽孢杆菌复合活菌制剂的研制［D］.大庆：黑龙江八一农垦大学，2008.

［10］ 龙淼，逄晓阳，朱连勤，等.牛瘤胃耐酸乳酸杆菌的分离与鉴定［J］.中国兽医学报，2009，29（3）：288-291.

［11］ 陈欣，潘素华，胡黎黎，等.人源乳酸杆菌耐酸耐胆盐能力的测定和鉴定［J］.现代预防医学，2006，33（3）：278-279.

［12］ 张董燕，季海峰，王雅民，等.鸡源乳酸杆菌M8最佳培养条件的确定及培养基优化［J］.华北农学报，2007，22（2）：171-174.

［13］ 玉山江，托乎提·阿及德，肖海霞，等.驴体况评分及营养需要的研究进展［J］.黑龙江畜牧兽医，2016（17）：53-58.

［14］ 于永志，马君峰.肉驴养殖关键技术［J］.中国动物保健，2017，19（2）：18-19.

Isolation，Identification，Biological Characteristics Study of a Strain of Lactobacillus casei from Donkeys

Liu Yu1，2，Yin Junyi1，Jiang Botao1，2，Shi Tongrui1，Xu Weisheng2，Yang Wenzhong2，Li Yang1，Chen Nannan1，Qin Pingwei1，Hou Meiru1，Wang Yan1，Zhu Zhanbo3
（1.Veterinary Science Research Institute of HeiLongJiang Province，Qiqihar 161006；2.Heilongjiang Three Donkeys Agricultural Science and Technology Co.，Ltd；3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang BaYi Agricultural University）

To isolate lactobacillus that could be used to develop micro-ecological preparations for donkeys，four fresh faeces of healthy donkeys were collected.A gram-positive，anaerobic and no spore strain was selected by isolation culture，morphological characteristics and cultivation characteristics.The strain was identified as Lactobacillus casei by biochemical identification and PCR identification，and it was numbered“LV1”.Strain LV1 was safe and non-pathogenic，suitable growth temperature was from 30 ℃ to 40 ℃.It could grow under conditions of pH3~8.It established foundation for developing lactobacilli micro-ecological preparations of donkey.

donkey；Lactobacillus casei；biological characteristics

S852.69

A

1002-2090（2017）06-0016-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.005

2017-08-25

黑龙江省科技厅科技攻关项目（GC13B404）。

刘宇（1982-），男，博士研究生，现主要从事兽医微生态学方面的研究工作。

史同瑞，男，研究员，E-mail：systr@sina.com；江波涛，男，研究员，E-mail：jbt999@126.com。