牛病毒性腹泻病毒人工感染泌乳兔试验

邢思毅，常敬伟，周玉龙，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛病毒性腹泻病毒人工感染泌乳兔试验

邢思毅，常敬伟，周玉龙，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为了解BVDV JH-1毒株对泌乳兔的致病性，分别采用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和静脉注射攻毒的方法感染泌乳兔。通过测定感染后泌乳兔的体温、观察临床、病理剖检和病原学检测等方法，可见泌乳兔接种病毒2 d内出现腹泻，但体温正常。个别泌乳兔有排出肠黏膜现象，剖检可见胃黏膜脱落、肠溃疡灶等病变。肠道黏膜经PCR方法可检测到BVDV。结果说明BVDV首次感染泌乳兔后，对泌乳兔产生致病性作用。

牛病毒性腹泻病毒；人工感染；泌乳兔

牛病毒性腹泻黏膜病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease viruses，BVDV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和羊边界病毒（Border disease virus，BDV）同属于黄病毒科（Flavivirdae）瘟病毒属（Pestivirus）[1]，这三种病毒在血清学上有具有一定交叉反应[2]，牛病毒性腹泻病毒能感染牛、鹿、山羊、绵羊和猪等多种偶蹄动物。BVDV是牛群中最重要的病原之一，给各国奶牛业和肉牛业均造成巨大的经济损失。牛感染BVDV的症状为腹泻、产奶量下降和发热等。牛感染BVDV还能出现免疫抑制，造成病牛潜在感染其他病原微生物[3]。如果BVDV感染妊娠阶段母牛，BVDV可穿透胎盘，可引起胎儿流产和弱胎，影响奶牛繁殖性能。感染BVDV免疫耐受的胎儿，可存活胎儿后向外界排毒[4]。家兔可以感染猪瘟病毒，而牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒同为一个病毒属，它们在抗原性和结构上联系密，牛病毒性腹泻病毒是否能够人工感染泌乳兔，因而进行了BVDV人工感染泌乳兔试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与细胞株

BVDV JH-1毒株和MDBK细胞均由黑龙江八一农垦大学预防兽医实验室保存。

1.1.2 引物的设计与合成

根据Gen Bank中BVDV基因序列，参考文献[5，6]，设计了扩增片段为288 bp的特异引物引物，并优化了反应条件，由哈尔滨博仕生物公司合成。

BVDV-F：5′-ATGCCCTATAGTAGGACTAGCA-3′

BVDV-R：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′

1.1.3 实验动物

实验动物购自吉林大学实验动物中心，体重0.5~1 kg左右泌乳兔，营养状况良好，临床观察健康。隔离饲养观察15 d，每天测体温2次，达到清洁级实验动物的要求，经BVDV检测抗原、抗体均为阴性。

1.1.4 主要试剂

RNA提取试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；PCR相关试剂购自Thermo公司。

1.1.5 毒株制备

将BVDV HJ-1毒株接种于长满单层MDBK中，收获病毒细胞培养物，-70℃保存备用。

1.1.6 病毒毒价测定

采用Reed-Muench法计算测定病毒的TCID50，病毒效价为105.2TCID50*mL-1。

1.2 方法

1.2.1 攻毒方法

将21只泌乳兔随机分为4组，前3组为实验组，每组6只，对照组3只。将BVDV JH-1毒株病毒液分别运用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和静脉注射的方法攻毒泌乳兔。滴鼻攻毒计量为2、4和8 mL；口腔灌胃攻毒计量为0.5、1和2 mL；静脉注射攻毒计量为1、2和4 mL。每个攻毒计量作重复2只，2只·笼-1。对照组接种同等剂量的MDBK细胞液。接种后每天采集粪便，冷冻备用，于攻毒后7 d剖杀，无菌采取肠道黏膜、呼吸道黏膜、脾脏、肝脏和肺脏等置于-70℃保存备用。

1.2.2 临床观察

接种后每天于下午4点测1次试验泌乳兔直肠温体温和观察临床症状，记录数据。

1.2.3 BVDV病原学检测

以cDNA为模板利用特异性引物BVDV-F/BVDV-R进行PCR反应。进行扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 临床症状和剖检观察

攻毒后2 d内如个别兔食欲略有减少，饮欲增加，活动减少，两天后即恢复正常。静脉注射感染2 mL组泌乳兔出现腹泻，其他未出现腹泻现象。如图1所示，脉注射感染2 mL组泌乳兔有排出肠黏膜现象。剖检观察，泌乳兔出现胃黏膜脱落、肠溃疡灶，其他器官无明显病变。

图1 泌乳兔的临床症状和剖检观察Fig.1 Results of the Clinical and autopsy observations in rabbits after infection with BVDV

2.2 体温变化

攻毒后泌乳兔体温的变化（图2），攻毒后2 d内泌乳兔体温均有不同程度的升高，最高体温达到39.5℃，但均在泌乳兔正常体温范围之内。2 d后试验组泌乳兔体温均恢复正常，直至处死，体温一直处于正常状态。整个试验过程中，对照组泌乳兔体温正常。

图2 泌乳兔体温的变化Fig.2 Results of the temperature in lactating rabbits after infection with BVDV

2.3 病原学检测

将采集呼吸道黏膜、肠道黏膜、肺脏、肝脏和脾脏等组织处理进行PCR检测，试验结果表明，仅肠道黏膜为阳性，扩增出大小为288 bp条带（图3），扩增片段与预期目的片段大小相符。

图3 各主要组织器官PCR检测结果Fig.3 The PCR results of BVDV in 5 infected samples

3 讨论

牛病毒性腹泻病毒以本源动物作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，在时间和空间上存在局限性，且许多实验在经费和方法上也受到限制。因此，借助于感染动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与本源动物疾病进行比较研究[7]。牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒同属于瘟病毒属，血清学检测和核苷酸序列上分析表明两者在抗原和蛋白组成上有相似性，并较高的同源性，它们具有较高的亲缘关系[8]。猪瘟病毒攻毒感染家兔可使其产生定型热[9]，而试验结果表明，牛病毒性腹泻病毒攻毒泌乳兔后虽然在攻毒后2 d体温有所升高，但泌乳兔攻毒后没有出现定型热反应。2006年，邓宇等[10]用耳缘静脉的方法将BVDV Oregon C24标准毒株感染3 kg左右家兔，研究了BVDV对家兔致病性表现，结果显示家兔攻毒后6 h体温有所升高，但6 h后即恢复正常，家兔对BVDV毒力具有减弱作用，通过剖检和临床观察，BVDV对家兔无致病性表现。2014年，卜凡亮等[11]运用牛病毒性腹泻病毒河南分离株对家兔的采用腹腔注射方法进行感染，通过体温测定、临床观察1周后剖杀，采用PCR技术对血清、脾脏、肝脏、淋巴结和肠黏膜进行检测。结果显示，家兔对牛病毒性腹泻病毒河南分离株的感染不呈现明显症状，牛病毒性腹泻病毒分离株对家兔无明显致病变影响。试验中泌乳兔静脉注射接毒2 mL组，体温均在正常内，2 d内个别出现腹泻现象。别泌乳兔有排出肠黏膜现象，剖检出现胃黏膜脱落、肠溃疡灶病变，说明BVDV首次感染泌乳兔后，对泌乳兔产生致病性表现。

［1］ 殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997. ［2］ Franch R.Classification and nomendature of viruse［J］.Arch virol，1991，51：228.

［3］ Brock K V.Diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections［J］.Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice，1995，11（3）：549-61.

［4］ 刘芳芳，师新川，孟相秋，等.牛病毒性腹泻的准确诊断及预防［J］.中国乳业，2016（3）：42-45.

［5］ Vilcek S，Greiser-Wilke I，Durkovic B，et al.Genetic diversity of recent bovine viral diarrhoea viruses from the southeast of Austria （Styria）［J］.Veterinary Microbiology，2003，91：285-291.

［6］ 邢思毅，倪宏波，周玉龙，等.牛群爆发口腔黏膜溃疡类疾病的实验室诊断［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（4）：46-49.

［7］ 倪宏波，宫大庆，姜海芳，等.边缘无浆体病动物模型的建立及其生理指标变化规律的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2010，22（4）：57-60.

［8］ 杨小燕，魏春华，刘建奎，等.猪源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定［J］.中国兽医科学，2011（1）：9-13.

［9］ 李超.猪瘟兔化弱毒疫苗株适应家兔的分子基础［D］.北京：中国农业科学院，2013.

［10］ 邓宇.牛病毒性腹泻病毒人工感染家兔试验［J］.动物医学进展，2006，27（1）：75-77.

［11］ 卜凡亮.BVDV河南分离株人工感染家兔试验［J］.当代畜禽养殖业，2015（1）：5-6.

Study on Artificial Infection of Bovine Viral Diarrhea Virus on the Lactaing Rabbits

Xing Siyi，Chang Jingwei，Zhou Yulong，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to understand the pathogenicity of JH-1 BVDV strain to the lactating rabbits，the lactating rabbits were infected with the methods of nasal drops，oral administration and intravenous injection.The results which were inspcted by measuring body temperature，clinical observation，pathological examination and etiological examination showed that there were diarrhea in 2 days after inoculating virus，but the body temperature was normal.Some lactating rabbits were discharged intestinal mucosa phenomenon，visible gastric mucosal shedding，intestinal ulcer lesions and other lesions.The BVDV was detected from the intestinal mucosa by PCR.The results showed that the lactating rabbits could be infected by BVDV，and it caused a pathogenic effect on the lactating rabbits.

BVDV；lactating rabbit；artificial infection

S858.21

A

1002-2090（2017）06-0013-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.004

2015-05-24

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2014-Y30）；黑龙江省农垦总局攻关项目（HNK125B-11-10A）。

邢思毅（1988-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2012级硕士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：nihongbo@sina.com。