毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸的分离提取及利用

黄小云，杨 莹，成 果，谢太理，管敬喜，张 劲*

（广西壮族自治区农业科学院 葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007）

毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸的分离提取及利用

黄小云，杨 莹，成 果，谢太理，管敬喜，张 劲*

（广西壮族自治区农业科学院 葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007）

采用溶剂提取法，选择乙醇体积分数、料液比、回流温度和回流时间4个因素，进行单因素和正交试验，优化毛葡萄酿酒皮渣中的齐墩果酸提取条件，通过有机溶剂萃取纯化，得到齐墩果酸粗提取物；并利用齐墩果酸粗提取物对葡萄酒及白兰地进行功能活性强化。结果表明，齐墩果酸最优化提取条件为：提取液选择体积分数95%乙醇，料液比1∶35（g∶mL），回流温度65℃，回流时间45 min。在此最优化条件下，齐墩果酸含量达到15.16 mg/g，经过纯化，得到粗提物纯度为23.95%。通过对毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸的提取工艺优化及利用研究，为葡萄酒酿酒皮渣的综合利用提供了新思路。

毛葡萄；酿酒皮渣；齐墩果酸；分离提取；利用

齐墩果酸（oleanolic acid，OA）分子式为C30H18O3，是一类五环三萜类化合物，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿，具有护肝、降糖、降脂、抗过氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等[1-3]药理作用，是治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎较理想的药物[4-5]。齐墩果酸结构复杂，人工合成步骤繁琐，目前主要从植物中提取再精制得到齐墩果酸[6]。前人研究主要集中在齐墩果酸在中草药中的含量测定及提取[7-11]，药理作用[12-13]方面的研究，对于果蔬中齐墩果酸的研究鲜有报导。

毛葡萄（Vitis quinquangularisRehd）别名野葡萄、五角叶葡萄、鸡葡萄，原产于中国，是我国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种，野生毛葡萄主要集中分布在广西都安地区。毛葡萄是广西分布最广、资源量最大及酿造加工利用最多的野生葡萄种类，我国每年利用的野生毛葡萄浆果约为8 000 t。毛葡萄具有含糖量和含酸量高的特点，同时还含有多种维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质及丰富的花色素双糖苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及白藜芦醇[14]（resveratrol，RES）等物质，用毛葡萄酿造的毛葡萄酒的总酚和原花青素含量很高，具有很高的抗氧化性，符合优质葡萄酒的要求[15-19]。

毛葡萄酿酒皮渣是毛葡萄酒酿造过程中的副产物，研究发现，广西毛葡萄皮及其酿酒皮渣中富含齐墩果酸，比新疆地区的几种葡萄皮和酿酒皮渣中的含量高，而通过发酵浸渍，齐墩果酸无法溶入葡萄酒中[20]，因此毛葡萄酿酒皮渣具有很大的利用价值。酿酒皮渣往往被作为垃圾处理，从毛葡萄酿酒皮渣中提取齐墩果酸不仅减轻环境压力还能使酿酒废弃物得到合理利用。提取的齐墩果酸经过氯仿萃取初步纯化，复溶于葡萄酒和白兰地中，探索齐墩果酸粗提物在酒中的回用可行性，为齐墩果酸功能型酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛葡萄：2016年8月采自广西罗城，品种为野酿2号，由广西农科院生物所鉴定。野酿2号毛葡萄酿酒皮渣（含葡萄籽）、野酿2号毛葡萄酒、白兰地由广西农科院葡萄与葡萄酒研究所实验室制备[11]。白兰地由白葡萄品种桂葡3号发酵蒸馏制备，酒精度为45.0%vol。

齐墩果酸标准品（纯度＞98%）：美国Sigma公司；甲醇（色谱级）：美国Fisher公司；无水乙醇、体积分数95%乙醇、氯仿等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；TG16-WS高速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；GZX-GF101-2-BS-Ⅱ电热鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱法色谱条件

齐墩果酸采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定，其色谱条件如下：Inert Sustain C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相：甲醇∶水=85∶15（V/V），检测器：紫外检测器，流速：1 mL/min，波长210 nm，柱温：30℃，进样量：10 μL。

1.3.2 齐墩果酸标准曲线绘制

精密称取齐墩果酸标准品10mg，无水甲醇定容至10mL，配制成1 mg/mL的齐墩果酸标准母液，准确吸取齐墩果酸标准母液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，无水甲醇定容至10 mL，配制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的系列齐墩果酸标准溶液，经0.45μm微孔膜过滤，取滤液按上述色谱条件进行HPLC分析。以齐墩果酸标准液质量浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制齐墩果酸标准曲线，按照标准曲线回归方程计算样品中齐墩果酸的含量。

1.3.3 酿酒皮渣前处理

称取酿酒皮渣1 000.00 g，分离皮渣与葡萄籽，皮渣置60℃恒温干燥箱中烘干，粉碎，计算皮渣得率，干粉备用。

1.3.4 回流法提取齐墩果酸

准确称取1.000 g皮渣干粉，加入适量浓度的乙醇，在设定的温度和时间条件下回流提取后离心（8 000 r/min、15 min）取上清液，上清液45℃条件下真空旋干，用无水甲醇溶解并定容至10 mL，稀释20倍后经0.45 μm微孔滤膜过滤，按照“1.3.1色谱条件”进行HPLC分析。

1.3.5 提取条件优化单因素试验

乙醇体积分数的确定：按1.3.4的试验方法，设置乙醇体积分数分别为12%、30%、50%、70%、95%、100%，在料液比为1∶30（g∶mL），回流温度为60 ℃，回流时间60 min的条件下提取酿酒葡萄皮渣的齐墩果酸，并进行HPLC分析。

料液比的确定：按1.3.4的试验方法，在乙醇体积分数为95%，回流温度为60℃，回流时间60 min的条件下，分别选取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），对酿酒皮渣中齐墩果酸进行提取，并进行HPLC分析。

回流温度的确定：按1.3.4的试验方法，在乙醇体积分数为95%，料液比1∶30（g∶mL），回流时间60 min条件下，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的水浴温度条件下提取酿酒皮渣中的齐墩果酸，并进行HPLC分析。

回流时间的确定：按1.3.4的试验方法，在乙醇体积分数为95%，料液比1∶30（g∶mL），水浴回流温度60 ℃的条件下，分别回流10 min、30 min、60 min、90 min、120 min提取酿酒皮渣中的齐墩果酸，并进行HPLC分析。

1.3.6 提取条件优化正交试验

根据单因素试验结果进行正交试验，以料液比、回流温度、回流时间为影响因素，以齐墩果酸含量为评价指标，进行3因素3水平正交试验，其因素与水平见表1。

表1 提取条件优化正交因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.7 齐墩果酸提取物纯化[21-22]

称取120.000g毛葡萄酿酒皮渣粉末（去籽，烘干粉碎），按照正交试验的最优条件回流提取毛葡萄皮渣中的齐墩果酸，过滤取上清液，45℃真空旋干，得到浸膏。浸膏加水（1∶1，V/V）混悬后用等量的氯仿萃取3次，合并氯仿层，真空旋干，回收氯仿，残渣用乙醇（8倍）回流溶解（65℃），活性炭脱色，过滤，浓缩滤液，放置，冷冻干燥得到提取物纯化粉末，称质量，计算酿酒皮渣中齐墩果酸提取率，其计算公式如下：

式中：m1为纯化提取冷冻干燥得到的粗提物粉末质量，g；c1为纯化提取冷冻干燥得到的粗提物粉末的质量分数，g/g；m2为酿酒皮渣样品取样质量，g；c2为直接提取得到的样品质量分数，g/g。

称取纯化提取冷冻干燥后的粗提物粉末0.010 g，用纯甲醇定容至10 mL，稀释5倍，用0.45 μm膜过滤，按照1.3.1高效液相色谱条件进行HPLC分析，计算齐墩果酸粗提物的纯度，其计算公式如下：

式中：v0为粗提物粉末用甲醇定容的体积，mL；c0为纯化提取

冷冻干燥得到的粗提物粉末进样溶液的含量，g/mL；M为纯化提取冷冻干燥后粗提物粉末的取样量，0.010g。

1.3.8 齐墩果酸提取物回用

准确称取1.000 g初步纯化后的齐墩果酸粗提物，用桂葡3号葡萄2次蒸馏酒（酒精度80.0%vol）溶解至100 mL，经0.45 μm微孔膜过滤，取滤液加入野酿2号毛葡萄酒（干型，酒精度12.0%vol）中，混匀，用0.45 μm微孔膜过滤，按照1.3.1高效液相色谱条件进行含量测定。另取滤液加入桂葡3号白兰地（酒精度45.0%vol）中，混匀，用0.45 μm微孔膜过滤，按照1.3.1高效液相色谱条件进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 齐墩果酸标准曲线绘制

根据HPLC的分析结果，齐墩果酸标准品在19.79 min出峰，色谱图见图1。以齐墩果酸标准液质量浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制齐墩果酸标准曲线，结果见图2。由图2可知，标准曲线回归方程为Y=5591X-29455，相关系数R2=0.995 8，表明二者线性关系良好。

图1 齐墩果酸标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of oleanolic acid standard substance

图2 齐墩果酸标准曲线Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.2 酿酒皮渣前处理结果及齐墩果酸的分析

对“1.3.3毛葡萄酿酒皮渣”进行前处理得率计算，葡萄皮渣中葡萄皮含量为82.83%，葡萄皮干燥得率为18.62%[11]。根据1.3.4试验方法步骤提取酿酒皮渣中的齐墩果酸，进行HPLC分析，色谱图见图3。由图3可知，齐墩果酸的出峰时间约为19.80 min，酿酒皮渣中齐墩果酸的含量测定结果为14.55 g/g。

图3 毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of oleanolic acid from Vitis quinquangularisskin residues

2.3 单因素试验结果与分析

2.3.1 乙醇体积分数对齐墩果酸提取的影响

用不同乙醇体积分数对酿酒皮渣中齐墩果酸进行提取，结果如图4所示。

图4 乙醇体积分数对齐墩果酸含量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on oleanolic acid content

由图4可知，齐墩果酸的含量在乙醇体积分数为12%～50%的范围内缓慢增加，当乙醇体积分数增加至70%时，齐墩果酸含量明显增加；当乙醇体积分数达到95%时，齐墩果酸含量达到最大，为14.51 mg/g；当乙醇体积分数为100%时，齐墩果酸含量有所下降。齐墩果酸溶于乙醇，随着乙醇体积分数的增加，齐墩果酸更易溶于提取液中，提取量增加，当乙醇体积分数达到95%时，提取量最高，继续增加乙醇体积分数可能使一些色素、亲脂性物质溶出，与齐墩果酸竞争提取液，降低提取量。因此，选用体积分数95%乙醇作为提取溶剂。

2.3.2 料液比对齐墩果酸提取的影响

按照不同料液比对齐墩果酸进行提取，结果如图5所示。

图5 料液比对齐墩果酸含量的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on oleanolic acid content

由图5可知，随着料液比在1∶10～1∶50（g∶mL）范围内增大，齐墩果酸含量呈先上升后缓降的趋势，当料液比为1∶40（g∶mL）时，齐墩果酸的含量最高，为15.01 mg/g；当料液比为1∶50（g∶mL）时，齐墩果酸含量有下降趋势。 取样量不变，提取液增加增大了齐墩果酸的扩散空间，齐墩果酸向低浓度方向扩散溶出，当提取液增加到一定程度，浓度差趋向平衡，溶液浓度不再增加。因此，选择料液比为1∶40（g∶mL）为宜。

2.3.3 回流温度对齐墩果酸提取的影响

采用不同回流温度对齐墩果酸进行提取，结果如图6所示。由图6可知，在30～70℃的温度范围内，齐墩果酸含量先缓慢上升再下降，在回流温度为60℃时，齐墩果酸含量达到最高，为14.66 mg/g；回流温度＞60℃之后，齐墩果酸含量有所下降。回流温度升高，提取液对样品的浸渍越充分，齐墩果酸越容易溶出，齐墩果酸含量增加，当回流温度＞60℃，齐墩果酸含量降低，可能是因为齐墩果酸在高温的条件下氧化分解，且高温条件下杂质溶出量增加，导致提取量下降。因此，选择回流温度60℃为宜。

图6 回流温度对齐墩果酸含量的影响Fig.6 Effect of reflux temperature on oleanolic acid content

2.3.4 回流时间对齐墩果酸提取的影响

采用不同回流时间对齐墩果酸进行提取，结果如图7所示。由图7可知，在回流时间为10～120 min的时间段内，齐墩果酸含量先缓慢上升再下降趋向平缓，当回流时间为60 min时，齐墩果酸含量最高，为14.66 mg/g；随着回流时间增加，酿酒皮渣粉末与提取溶剂接触得越充分，齐墩果酸含量增加，但回流时间太长也可能导致齐墩果酸与其他溶出杂质结合，使其含量下降。因此，选择回流时间60 min为宜。

图7 回流时间对齐墩果酸含量的影响Fig.7 Effect of reflux time on oleanolic acid content

2.4 正交试验优化提取工艺研究

根据单因素试验结果，设计3因素3水平的正交试验L9（34），正交试验结果与分析如表2所示。

表2 提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

由表2可知，在3个影响因素中，对齐墩果酸的提取质量浓度影响的顺序为B＞C＞A，即回流温度＞回流时间＞料液比。 最优水平组合为A1B3C1，即料液比为1∶35（g∶mL），回流温度65℃，回流时间45 min。按最优提取条件，毛葡萄酿酒皮渣中的齐墩果酸含量为15.16 mg/g。

2.5 齐墩果酸纯化结果分析

在最佳提取条件下提取毛葡萄酿酒皮渣中的齐墩果酸，经过氯仿萃取纯化，纯度为23.95%，提取率为73.94%。

2.6 齐墩果酸提取物回用试验结果分析

齐墩果酸能溶于甲醇和乙醇，但甲醇有毒，不能用于食品中，齐墩果酸难溶于体积分数＜50%的乙醇，选择乙醇含量较高的桂葡3号葡萄2次蒸馏酒（酒精度80.0%vol）溶解纯化的齐墩果酸粗提物，经过HPLC检测，溶液中齐墩果酸含量为2 632.58 μg/mL，取定量滤液加入野酿2号毛葡萄酒（干型，酒精度12.0%vol）中和白兰地（酒精度45.0%vol）中，毛葡萄酒中未检测出齐墩果酸，白兰地中检测出齐墩果酸，但检测到的齐墩果酸含量为24.46 μg/mL，低于齐墩果酸理论加入49.13 μg/mL的含量。结果表明，齐墩果酸不溶于低酒精度的毛葡萄酒，能部分溶于高酒精度的白兰地，即齐墩果酸溶于高酒精度蒸馏酒后加入低酒精度的葡萄酒中不能使葡萄酒中的齐墩果酸含量增加，但加入高酒精度的白兰地能增加白兰地中齐墩果酸的含量。利用葡萄皮渣提取的齐墩果酸能够对白兰地产品实现功能活性强化，达到齐墩果酸提取物的利用效果。齐墩果酸在白兰地中添加量对人体的量效关系、稳定性因素以及齐墩果酸提取物的食品安全性等方面需要进一步深入研究。

3 结论

通过单因素及正交试验得到毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸的最佳提取工艺为料液比1∶35（g∶mL），回流温度65℃，回流时间45 min，各因素对试验结果的影响顺序为回流温度＞回流时间＞料液比，此最佳工艺条件下齐墩果酸的提取率为15.16 mg/g。用氯仿萃取纯化提取的齐墩果酸，得率为73.94%，纯度为23.95%。利用齐墩果酸粗提物对葡萄酒和白兰地进行功能活性强化，齐墩果酸回用于白兰能达到了一定的功能活性强化目的。齐墩果酸的优化提取工艺及回用的研究为葡萄酒酿酒皮渣的综合利用提供了新思路。

对比从夏枯草[23]、白苏[24]等植物中提取的齐墩果酸，毛葡萄酿酒皮渣提取物得到的齐墩果酸含量更高，甚至跟市场上的保健食品（胶囊、片剂）[25]的齐墩果酸含量相当。表明广西毛葡萄酿酒皮渣中的齐墩果酸具有较高的工业提取价值。

本研究的开展探索了野生毛葡萄中齐墩果酸的含量分布、分离提取工艺及废弃物综合利用途径等方向，开拓了葡萄酿造废弃物综合利用的新方向，具有重要的理论和应用价值。今后将以该研究成果为基础，继续深入开展葡萄中齐墩果酸及其他生物活性成分的分布状况、可利用性及生理代谢调控规律等方向的研究，重点关注广西独特温光资源条件下开展的一年两收鲜食和酿酒葡萄品种中功能性成分的含量、积累、基因调控及环境因素影响机制等研究，深入挖掘葡萄中对人体具有保健功能的生物活性成分，为葡萄深加工和葡萄酿造废弃物的综合开发利用提供更多新思路。

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Separation,extraction and utilization of oleanolic acid inVitis quinquangularisskin residues

HUANG Xiaoyun,YANG Ying,CHENG Guo,XIE Taili,GUAN Jingxi,ZHANG Jin*
（Viticultrue and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China）

By single factor and orthogonal experiments with the four factors（including ethanol concentration,solid-liquid ratio,reflux temperature and time）,the extraction conditions of oleanolic acid fromVitis quinquangularisskin residues were optimized by solvent extraction method.The oleanolic acid crude extracts were obtained by extraction and purification of organic solvent.The functional activity of wine and brandy was enhanced by the oleanolic acid crude extracts.The results showed that the optimum extraction conditions of oleanolic acid were ethanol concentration 95%,solidliquid ratio 1∶35 （g∶ml）,reflux temperature 65 ℃ and time 45 min.Under the optimum conditions,oleanolic acid content was up to 15.16 mg/g,after purification,the purity of the crude extracts was 23.95%.The extraction process optimization and utilization of oleanolic acid fromV.quinquangularisskin residues were researched,which provided a new idea for the comprehensive utilization of wine-brewing skin residues.

Vitis quinquangularis;wine-brewing skin residues;oleanolic acid;separation and extraction;utilization

TS261.2；TS261.9

0254-5071（2017）12-0110-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.023

2017-07-14

广西农业科学院基本科研业务专项项目（桂农科2017YM40；桂农科2015YM05；桂农科2015YT85）

黄小云（1993-），女，研究实习员，本科，研究方向为葡萄酒酿造工艺。

*通讯作者：张 劲（1986-），男，助理研究员，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏。