响应面法优化米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶工艺

王 浩，卢梓荧，谭⒈斯，刘 芳，丁利君*,刘 丹，蓝德安

（1.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广州市华琪生物科技有限公司，广东 广州 510250）

响应面法优化米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶工艺

王 浩1，卢梓荧1，谭⒈斯1，刘 芳1，丁利君1*,刘 丹1，蓝德安2

（1.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广州市华琪生物科技有限公司，广东 广州 510250）

为提高米曲霉（Aspergillus oryzae）液体发酵生产中性蛋白酶的能力，采用单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验筛选碳源、氮源和无机盐，并通过响应面法优化其最佳配比，提高米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的活性。结果表明，米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的最佳碳源、氮源和无机盐分别为玉米粉、牛肉膏和氯化钙，发酵的最优条件为玉米粉添加量17 g/L，牛肉膏添加量10 g/L，氯化钙添加量0.04 g/L，接种量5%，装液量60 mL/250 mL，于30℃条件下发酵84 h。在此优化条件下，产生的中性蛋白酶活性从最初的21.4 U/mL提高至110.5 U/mL。

米曲霉；液体发酵；中性蛋白酶；Plackett-Burman试验；响应面

中性蛋白酶作用条件温和，最适作用pH介于6.0～7.5之间[1]，是一类胞外酶，易于下游加工过程分离提取[2-3]，并且是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂[4-5]。作为一种生物催化剂，中性蛋白酶具有催化反应速度快、无工业污染等优点[6]，在经济、社会、环保等方面发挥着巨大效益，已经成为相关领Ⅱ的研究热点[7]。据统计，微生物蛋白酶占据了整个酶销售市场约40%的份额，已成为市场上蛋白酶生产的主要来源[8-9]。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是酱油酿造中的常用生产菌，是一种食品安全菌株，稳定性高，能耐较高的温度，具有很强的产中性蛋白酶的能力[10]。目前，国内外主要通过固体发酵生产中性蛋白酶，但固体发酵培养时间长，且反应条件不易控制，重复性较差，而液体发酵培养时间相对较少，反应条件容易实时监控，易于工业扩大化生产[11-12]。利用米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶在国外已有相关报道，而在国内则研究很少。因此，本实验通过单因素试验、Plackett-Burman试验筛选出对米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶有显著影响的碳源、氮源和无机盐成分，并利用响应面试验分析法，优化液体发酵生产中性蛋白酶的工艺条件，以期提高中性蛋白酶的活性，为米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉（Aspergillus oryzae）：广州市华琪生物科技有限公司。

斜面培养基（查氏培养基）：以100mL计，蔗糖3g，NaNO30.3 g，K2HPO4·3H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，琼脂2 g，pH自然，121℃灭菌20 min。

种子培养基：玉米粉20 g/L，酵母粉10 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO32 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

初始发酵培养基：玉米粉20g/L，牛肉膏15g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO32 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

福林酚：上海麦克林生化科技有限公司；酪氨酸、干酪素：天津市进丰化工有限公司；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1200型紫外/可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；YX-280手提式压力蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；PHS-3C型实验室pH计：上海智光仪器仪表有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州净化设备有限公司；HZQ-F160A摇床：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉初始发酵条件

将冻干米曲霉转接至斜面培养基，30℃活化3～4 d，直到有绿色孢子生成。挑取斜面菌种3环，接种至装液量为100 mL/250 mL三角瓶的液体种子培养基中，于30℃、120 r/min的摇床上培养54 h。

初始发酵培养基装液量为70 mL/250 mL，接种量5%，于30℃、100r/min，发酵84h。发酵结束后，发酵液4000r/min离心20min，取上清液用1mol/LNaOH调pH至6.0～7.5备用。

1.3.2 单因素试验

在米曲霉初始发酵条件的基础上，以中性蛋白酶活性为指标，分别考察40g/L碳源（玉米粉、甘蔗渣、茶籽壳、红薯粉、麸皮、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖）、玉米粉添加量（10g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L）、20 g/L氮源（牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉、罗非鱼粉、酵母粉、硫酸铵、干酪素）、牛肉膏添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、发酵时间（66 h、72h、78h、84h、90h、96h）、种龄（48h、54h、60h、66h、72h）、接种量（1%、3%、5%、7%、9%）、装液量（50 mL/250 mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL）对米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶活性的影响。其中，在对某一因素水平进行探讨时，先将其他因素固定在其最优水平上，然后对目标因素进行考察[13]。

1.3.3 Plackett-Burman试验

使用Design-Expert 7.0.0软件进行Plackett-Burman试验[14]。无机盐是微生物生长和代谢不可或缺的重要成分，本实验在查阅相关文献的基础上[15]，选取了MgSO4·7H2O、KCl、KNO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·3H2O、（NH4）2SO4、ZnSO4、CaCl2这八种无机盐作为影响因素进行全面考察。选择试验次数 N=12及11因子试验设计，以 X4、X8、X11作为空白用以估计实验误差，以 X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10分别代表MgSO4·7H2O、KCl、KNO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·3H2O、（NH4）2SO4、ZnSO4、CaCl2添加量。 每个因素取高低2个水平，低水平为0，PB试验因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 响应面试验优化

根据单因素试验和Plackett-Burman试验结果，确定了最佳的碳源、氮源和无机盐，运用数据分析软件Design-Expert 7.0.0中的中心组合设计（central composite design，CCD）法，以玉米粉添加量（A）、牛肉膏添加量（B）、氯化钙添加量（C）为变量，设计3因素3水平的响应面试验，因素与水平设计见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments g/L

中性蛋白酶酶活采用国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[13]中的方法测定，其计算公式如下：

式中：OD600nm为样品适当稀释后酪氨酸吸光度值；K为吸光常数，即当吸光度值为1时的酪氨酸的量，97.01 μg；4为4 mL反应液取出1 mL测定（即稀释4倍）；N为发酵液稀释的倍数；10为反应时间，min。

中性蛋白酶活性定义：在40℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为1个中性蛋白酶活力单位，以U/mL表示。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线的建立

以酪氨酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制酪氨酸标准曲线，结果如图1所示。由图1可知，酪氨酸标准曲线回归方程为y=0.010 1x+0.020 2（相关系数R2=0.999 26），表明二者呈良好的线性关系。根据酪氨酸标准曲线方程，计算发酵液中中性蛋白酶活性。

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 碳源的筛选

在米曲霉初始发酵条件的基础上，研究40g/L玉米粉、甘蔗渣、茶籽壳、红薯粉、麸皮、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖对中性蛋白酶活性影响，结果见图2。由图2可知，茶籽壳作碳源的发酵培养基得到的中性蛋白酶活性最低，而用玉米粉和蔗糖两种碳源获得的中性蛋白酶活性较高。其中，玉米粉发酵得到的中性蛋白酶活性最高，达到了21.4 U/mL，又由于玉米粉的价格便宜，性价比高，所以选择玉米粉为最佳碳源。

图2 不同碳源对中性蛋白酶活性的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on neutral protease activity

图3 玉米粉添加量对中性蛋白酶活性的影响Fig.3 Effect of corn flour addition on neutral protease activity

玉米粉添加量对中性蛋白酶活性的影响见图3。由图3可知，以不同质量浓度的玉米粉为碳源，配制发酵培养基，随着玉米粉质量浓度的增大，中性蛋白酶活性先增后减。而且由图3中不难看出玉米粉添加量的不同对中性蛋白酶活性的影响较大，10 g/L和40 g/L的玉米粉添加量得到的中性蛋白酶活性都在20 U/mL左右，但20 g/L的玉米粉添加量最后得到的酶活却最高，为32.9 U/mL，提高了约1/3。因此，选择玉米粉添加量为20 g/L。

2.3 氮源的筛选

在米曲霉初始发酵条件的基础上，固定玉米粉添加量为20 g/L，研究20 g/L牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉、罗非鱼粉、酵母粉、硫酸铵、干酪素对中性蛋白酶活性影响，结果见图4。由图4可知，以硫酸铵为无机氮源获得的中性蛋白酶活性很低，而以有机氮源牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉、罗非鱼粉等发酵得到的中性蛋白酶活性都较高，说明米曲霉液体发酵使用有机氮源比无机氮源好。而且以牛肉膏为有机氮源获得的中性蛋白酶活性最高，所以选择最佳氮源为牛肉膏。

图4 不同氮源对中性蛋白酶活性的影响Fig.4 Effects of different nitrogen sources on neutral protease activity

图5 牛肉膏添加量对中性蛋白酶活性的影响Fig.5 Effect of beef extract addition on neutral protease activity

牛肉膏添加量对中性蛋白酶活性的影响见图5。由图5可知，当牛肉膏添加量＞15 g/L时，中性蛋白酶活性逐渐降低，20 g/L牛肉膏添加量得到的中性蛋白酶活性只有24.7 U/mL，降低了约40%，这可能是因为过多的氮源用于菌体生长，产中性蛋白酶少；而牛肉膏添加量为5～15 g/L时，中性蛋白酶活性随牛肉膏添加量的增加而增大；当牛肉膏添加量为15g/L时，中性蛋白酶活性最大为40.8U/mL。因此，选择牛肉膏添加量为15 g/L。

2.4 其他培养条件对中性蛋白酶活性的影响

在确定了米曲霉液体发酵的碳源、氮源及其添加量的基础上，以20 g/L玉米粉为碳源，15 g/L牛肉膏为氮源，研究其他培养条件（发酵时间、种龄、接种量、装液量）对中性蛋白酶活性的影响，单因素试验结果见图6。由图6a可知，发酵时间过短，则发酵不完全，中性蛋白酶活性较低；发酵时间过长，则菌体自溶，消耗了大部分中性蛋白酶；当发酵时间为72～84 h时，中性蛋白酶活性较大，最佳发酵时间为84 h。由图6b可知，当米曲霉的种龄为48～60 h时，中性蛋白酶活性较大，说明该时段的菌体细胞达到了对数生长期，活力旺盛，产中性蛋白酶能力强，最佳种龄为54 h。由图6c可知，添加3%～7%种子液的发酵培养基中性蛋白酶活性较大，说明该接种量的菌体恰好能利用培养基中的营养物质发酵产中性蛋白酶，既不会造成营养富集，也不会造成营养不够，最佳接种量为5%。由图6d可知，装液量过高，则溶氧较少，不能满足菌体生长；装液量过低，则溶氧丰富，营养成分被大量用于菌体自身生长繁殖，产中性蛋白酶少；最佳装液量为60 mL/250 mL，中性蛋白酶活性达到最大53.6 U/mL。

图6 不同培养条件对中性蛋白酶活性的影响Fig.6 Effect of different culture conditions on neutral protease activity

2.5 无机盐的筛选

8种无机盐的Plackett-Burman试验结果与分析见表3，各因素主效应分析结果见表4。由表4可知，Prob＞F值大于0.1表示该因子不显著，应该舍去；该模型的Prob＞F值0.029 7＜0.05，表示该模型是显著的。其中CaCl2的Prob＞F值为0.005 9，是所有八种无机盐中最小的，所以氯化钙是对中性蛋白酶活性影响最显著的无机盐。然而却观察到CaCl2对中性蛋白酶活性有相对较大的负影响，可能是高浓度的CaCl2造成米曲霉细胞膜内外渗透压失去平衡，使米曲霉失活，抑制了米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的能力。

表3 Plackett-Burman试验结果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

表4 各因素主效应分析结果Table 4 Analytic results of main effects of each factor

添加CaCl2对中性蛋白酶活性作用明显，这可能是因为大多数微生物中性蛋白酶是含有金属元素的，部分酶蛋白含有一分子钙，起着酶同底物之间的桥梁作用，所以适宜的钙离子浓度能增加中性蛋白酶的稳定性[16]。进一步考察氯化钙添加量（0、0.01 g/L、0.06 g/L、0.12 g/L、0.18 g/L、0.24 g/L）对中性蛋白酶活性影响，结果见图7。由图7可知，添加CaCl2的发酵培养基中性蛋白酶活性比未添加的高，当氯化钙添加量为0.06 g/L时，中性蛋白酶活性达到了最高的83.5 U/mL，较之前单因素试验结果最好的53.6 U/mL提高了约56%，再继续添加氯化钙，则中性蛋白酶活性降低。因此，本次实验选择氯化钙添加量为0.06 g/L。

图7 氯化钙添加量对中性蛋白酶活性的影响Fig.7 Effect of calcium chloride addition on neutral protease activity

2.6 响应面试验结果分析

根据单因素试验和Plackett-Burman设计结果，可明显看出，玉米粉添加量（A）、牛肉膏添加量（B）和氯化钙添加量（C）3个因素对中性蛋白酶活性的影响最大。所以，采用响应面试验中的中心组合设计（CCD）法对玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化钙添加量进行3因素3水平优化，以中性蛋白酶活性（Y）为响应值，响应面试验设计与结果见表5。回归模型的方差分析结果见表6。

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Design and results of response surface experiments

利用Design-Expert7.0.0对表5结果进行拟合，得到以中性蛋白酶活性Y为响应值，对自变量玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化钙添加量3个因素的多元二次回归方程回为：Y=325.293 57+0.048 720A-9.755 49B-5 281.431 65C+0.056 750AB+76.812 50AC+151.875 00BC-0.109 48A2-0.162 85B2+9 664.753 57C2。

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，回归模型P值＜0.000 1，说明该回归模型具有显著性；失拟项P值为0.069 3＞0.05，不显著，说明回归拟合的情况较好，模型复相关系数R2=0.944 7，表示有94.47%的响应值变化可用该模型来解释，说明试验可靠性较高，可以用其进行米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的活性预测和分析。对回归方程各项的方差分析结果表明，方程的一次项A、B，交互项AC、BC及二次项A2的P值均＜0.01，极显著，一次项C是显著的（P＜0.05），而交互项AB不显著（P＞0.05）。各因素对中性蛋白酶活性影响依次为B（牛肉膏添加量）＞A（玉米粉添加量）＞C（氯化钙添加量）。

为进一步直观分析响应面优化效果，根据回归模型绘制各因素交互作用对中性蛋白酶活性影响的响应曲面和等高线图，结果见图8。响应面及其等高线的形状可直观反⒊各因素间的交互作用对中性蛋白酶活性的影响[17]。玉米粉添加量和牛肉膏添加量对中性蛋白酶活性影响的的交互作用不显著；表明玉米粉添加量和氯化钙添加量对中性蛋白酶活性影响的交互作用极显著；牛肉膏添加量和氯化钙添加量对中性蛋白酶活性影响的的交互作用较显著。且它们对响应值的交互影响显著性为：AC＞BC＞AB。

通过对模型分析确定米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的最优条件为玉米粉添加量16.85g/L，牛肉膏添加量10g/L，氯化钙添加量0.04g/L。此条件下中性蛋白酶活性的理论值为107.48 U/mL。根据所得的最优条件进行3组平行试验进行验证。为方便实际操作，将上述最优条件简化为玉米粉添加量17g/L，牛肉膏添加量10g/L，氯化钙添加量0.04 g/L，得到的中性蛋白酶活性为110.5 U/mL，此结果与最优条件下所得的结果相差不大。由此可见，采用响应面法对米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶工艺进行优化是有效的。

图8 玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化钙添加量交互作用对中性蛋白酶活性影响的响应面和等高线图Fig．8 Response surface plots and contour line of effects of interaction between corn flour addition，beef extract addition and calcium chloride addition on neutral protease activity

3 结论

本研究通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面法优化得到米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的最优条件为：玉米粉添加量17 g/L，牛肉膏添加量10 g/L，氯化钙添加量0.04 g/L，接种量5%，装液量60 mL/250 mL，于30℃条件下发酵84 h。在此条件下，中性蛋白酶活性从最初的21.4 U/mL提高至110.5 U/mL。结果表明，响应面法优化米曲霉液体发酵生产中性蛋白酶的工艺条件是合理可靠的，本实验能为进一步的液体发酵生产中性蛋白酶研究提供一定的理论依据。

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Optimization of liquid-state fermentation conditions for production of neutral protease by Aspergillus oryzaewith response surface methodology

WANG Hao1,LU Ziying1,TAN Yingsi1,LIU Fang1,DING Lijun1*,LIU Dan1,LAN Dean2
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China;2.Guangzhou Huaqi Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510250,China）

To improve the neutral protease-producing ability ofAspergillus oryzaewith liquid-state fermentation,the carbon source,nitrogen source and inorganic salts were screened by single factor tests and Plackett-Burman （PB）experiments.The optimum formulas were optimized by response surface methodology to improve the activity of neutral protease in the production ofA.oryzaefermentation.The results showed that the optimum carbon source,nitrogen source and inorganic salts were corn flour,beef extract and calcium chloride,respectively.The optimum fermentation conditions were corn flour 17 g/L,beef extract 10 g/L,calcium chloride 0.04 g/L,inoculum 5%,liquid volume 60 ml/250 ml,fermentation temperature 30℃and time 84 h.Under the conditions,the activity of neutral protease increased from 21.4 U/ml to 110.5 U/ml.

Aspergillus oryzae;liquid-state fermentation;neutral protease;Plackett-Burman experiments;response surface methodology

TS201.3

0254-5071（2017）12-0040-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.009

2017-10-12

广东省教育部产学研合作重大专项项目（2013A090100009）

王 浩（1994-），男，硕士研究生，研究方向为微生物发酵。

*通讯作者：丁利君（1965-），女，教授，硕士，研究方向为农产品加工与天然产物化学。