耦合吸附树脂对细胞酶法合成谷胱甘肽的影响

万伟建，段 超，孙怡然，段学辉*

（南昌大学 食品学院 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

耦合吸附树脂对细胞酶法合成谷胱甘肽的影响

万伟建，段 超，孙怡然，段学辉*

（南昌大学 食品学院 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

通过静态吸附-解吸试验从3种吸附树脂中筛选出最适合分离谷胱甘肽（GSH）的树脂，将其与酵母渗透细胞耦合，通过补加前体物质，酶法合成GSH。结果表明，在试验的3种树脂中，D301吸附效果最佳。采用单因素和正交试验法，确定酶法合成GSH的优化工艺为：反应2.0 h后添加树脂2.0 g/10 mL，反应3.0 h时补加60%初始浓度的前体物质，最终得到GSH产量1 154 mg/L，与未添加树脂和前体合成法相比GSH产量提高77.5%。

谷胱甘肽；树脂；酶法合成；吸附

谷胱甘肽（glutathione，GSH）作为一种同时含有γ-谷氨酰基和巯基的活性多肽化合物[1-2]，具有抗氧化、解毒和维持细胞内稳态等生理功能[3-5]，在医疗[6-7]、食品[8]及化妆品行业[9]需求在逐年增长[10]。目前，工业生产GSH主要采用液体发酵和酶法合成。酶法合成GSH是利用细胞自身γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及谷胱甘肽合成酶，在反应体系中添加前体氨基酸、能量及辅助因子合成GSH，具有专一性强、反应条件温和及前体转化率高等优点[11-12]，但GSH合成酶系受到终产物的反馈抑制[13]，使GSH合成效率及前体转化率不高，进而影响GSH终产量[14]。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可选择吸附水溶液中各类有机物，起到分离纯化作用。树脂吸附量大，易解吸，再生简便且选择性良好，工艺成熟[15]。LIU S R等[16]通过采用吸附树脂D-152，吸附分离发酵液产物ε-聚赖氨酸，将产量由0.8 g/L提升至2.9 g/L。

酵母细胞生长速度快，合成产物能力稳定，是生物合成的优势菌。通过物理、化学和基因调控的方法，可改变细胞通透性，降低或解除反馈抑制，达到高产的目的。LI W等[17]利用冻融法对细胞进行渗透处理，改变了细胞通透性，使GSH产量达到3.4 g/L。倪晔等[18]采用十六烷基三甲基溴化铵对酵母细胞通透性处理20 min后，可将全细胞酶活提高2倍以上。PLOKHOV A Y等[19]在53℃高温处理表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌1 h，提高工程菌通透性，使菌体催化活力提高3倍。

本试验采用酵母渗透细胞耦合吸附树脂法，从反应液中分离终产物GSH，减少反馈抑制，促进酶反应正向进行，简化下游分离过程，通过前体物质补加提高GSH产量，提高GSH酶法合成效率，以期为酶法合成GSH工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

絮凝酵母（Saccharomyces cerevisiae）：南昌大学重点实验室保存。

D001型阳离子交换树脂、D301型阴离子交换树脂、001x7型强酸阳离子交换树脂：江苏苏青水处理工程集团有限公司；还原型谷胱甘肽（纯度98%）、L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）、L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）、L-甘氨酸（L-glycine，L-Cly）：阿拉丁试剂有限公司；四氧嘧啶（纯度为98%）：上海麦克林生化试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）、六水合氯化镁（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）：汕头市西陇化工股份有限公司；其他试剂皆为国产分析纯。

渗透溶液：准确称量2g十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate，SDS），蒸馏水溶解配制成1 L溶液。

酶反应液：以pH7.0磷酸缓冲液配制，L-Glu30mmol/L，L-Cys 15 mmol/L，L-Gly 60 mmol/L，葡萄糖 500 mmol/L，MgCl2·6H2O 10 mmol/L。

洗脱液：60%乙醇+10%氨水+30%去离子水配制[20]。

1.2 仪器与设备

AL104电子分析天平：瑞士MettlerToledo公司；DSX-280A手提式蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器：江苏太仓实验设备厂；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；756PC紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养[21]与渗透

将活化好的酵母菌接种到含50mL种子培养液的250mL锥形瓶中，30℃、200 r/min振荡培养1 d；种子液以体积比10%接种到含50 mL细胞发酵液的250 mL锥形瓶中，30℃、200 r/min振荡培养1 d；收集发酵液，于4℃冷冻离心机中8000r/min离心10min，除去上清液，收集细胞，无菌水洗涤3次。将收集的细胞在渗透溶液中渗透30min，离心收集备用。

1.3.2 吸附树脂预处理

新树脂含有大量杂质，影响吸附能力，需先进行预处理。先用清洁蒸馏水反复清洗，再用无水乙醇浸泡24h，蒸馏水清洗干净。若是阴离子交换树脂，先用2倍体积的1 mol/L的HCl溶液浸泡吸附树脂3 h，蒸馏水反复冲洗直至流出水为中性。再用2倍体积的1mol/L的NaOH溶液浸泡吸附树脂3 h，蒸馏水反复冲洗直至流出水为中性待用。若为阳离子交换树脂，水洗后采用先碱后酸次序处理，其用量、时间同阴离子交换树脂，洗净备用。

1.3.3 吸附树脂的筛选

预先准备质量浓度为200 mg/L的GSH粗提液。准确称量1 g上述预处理过的D001型阳离子交换树脂、D301型阴离子交换树脂、001x7型强酸阳离子交换树脂于100 mL锥形瓶中，再加入配制好的GSH粗提液10mL，37℃、160r/min振荡吸附，测定上清液中GSH的质量浓度，采用公式（1）-（2）计算吸附率（E）和吸附量（Qe）。将吸附树脂与上清液分离，蒸馏水洗净，用10 mL洗脱液在锥形瓶中解吸，测定上清液中GSH的质量浓度，用公式（3）-（4）计算解吸率（D）和解吸量（Qd）。公式如下：

式中：E为吸附率，%；Qe为吸附量，mg/g；D为解吸率，%；Qd为解吸量，mg/g；C0为初始质量浓度，mg/mL；C1为平衡后质量浓度，mg/mL；C2为解吸液质量浓度，mg/mL；V为吸附液体积，mL；V1为解吸液体积，mL。

1.3.4 吸附树脂添加量与添加时间对GSH合成的影响

将一定质量吸附树脂按照不同时间添加到酶反应液中，37℃、160 r/min摇瓶振荡反应6 h。反应结束后，离心收集上清液，适当稀释后测GSH含量；吸附树脂用蒸馏水冲洗后置于洗脱液中解吸，适当稀释后测GSH含量，两者相加为酶反应合成GSH总量。

1.3.5 前体物质补加量与补加时间对GSH合成的影响

添加吸附树脂后，将不同浓度前体物质按照不同时间添加到酶反应液中，37℃、160 r/min摇瓶振荡反应。反应结束后，离心收集，上清液适当稀释后测GSH含量；吸附树脂用蒸馏水清洗后置于洗脱液中解吸，适当稀释后测GSH含量，两者相加为酶反应合成GSH总量。

1.3.6 GSH合成条件优化正交试验

在上述单因素基础上，确定最佳树脂添加时间、树脂添加量、前体补加量和前体补加时间，以这4个因素为自变量，GSH产量为最终指标，设计4因素3水平L9（34）共9个试验点的正交试验。

1.3.7 GSH含量测定方法

GSH含量用四氧嘧啶法[22]测定，测定吸光度值，并依据GSH标准曲线计算GSH含量。

2 结果与分析

2.1 GSH标准曲线

采用GSH标准品配制质量浓度为0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的标准溶液。 取每份标准溶液1 mL，依次添加0.1 mol/L四氧嘧啶，0.5 mol/L磷酸盐缓冲液，0.1 mol/L NaOH溶液各1 mL，振荡混匀，反应6 min后，加入1 mol/L NaOH溶液1 mL，充分摇匀，在波长305 nm处测定吸光度值。并以GSH的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标制作标准曲线，结果如图1所示。

由图1可知，线性回归方程为y=10.345x+0.000 1，R2=0.9999。说明在质量浓度0～0.08mg/mL范围内两者线性关系良好。超过这个范围，吸光度值与GSH质量浓度有偏差，实验中的酶反应液GSH需经过一定稀释后方可测吸光度值。

图1 谷胱甘肽标准曲线Fig．1 Standard curve of glutathione

2.2 吸附树脂的筛选

吸附树脂本身的多孔性构造决定了它具有强吸附性，作为一种新兴分离材料，不同吸附树脂对吸附介质的吸附能力不同，吸附容量也有很大差别。通过查阅GSH性质、结构及吸附树脂在GSH分离纯化中的应用，本试验选取D001型、D301型、001x7型离子交换吸附树脂作为试验材料，粗提液成分复杂，模拟GSH酵母体内合成环境，在37℃、160 r/min，自然pH条件下，考察其对GSH吸附与解吸能力，并对最优树脂作静态吸附-解吸平衡曲线，其结果如图2、图3所示。

图2 吸附树脂的吸附量、解吸量和解吸率Fig．2 Adsorption，desorption and desorption rate of adsorption resin

由图2可知，3种吸附树脂的吸附能力与解吸能力不尽相同，在有底物存在的粗提液基础上，底物与GSH的等电点不同，吸附能力也不同，从吸附量均达到1.7 mg/L可以看出，树脂的添加会优先考虑吸附GSH。其中弱碱性阴离子交换树脂D301能吸附93.4%的GSH，吸附能力强，吸附容量大，效果最好，解吸率80.8%达到最大。综合考虑，选择吸附与解吸性能最好的弱碱性阴离子交换树脂D301作为酶法合成GSH的耦合吸附树脂。

由图3可知，树脂D301吸附速率快，容量高。解吸80min后，解吸率基本进入平台期，吸附100min，吸附率可达93.4%，增加吸附时间，吸附率不会再有明显变化，故选择静态吸附时间是100 min。

图3 树脂D301静态吸附解吸平衡曲线Fig．3 Equilibrium curve of static adsorption desorption of resin D301

解吸后的吸附树脂经过再生处理，可继续作为吸附树脂使用，弱碱性阴离子交换树脂D301经过5次重复利用，由于树脂吸水膨胀，干燥后恢复过程中内部颗粒来回移动并产生内应力，致使树脂发生磨损和破坏，吸附能力略有下降。

2.3 吸附树脂与渗透细胞耦合

2.3.1 渗透细胞酶法合成GSH的变化规律

经过渗透处理，可改变细胞通透性，使细胞内生成的GSH分泌到胞外，降低反馈抑制。渗透细胞酶法合成GSH的变化规律见图4。由图4可知，在酶合成反应时间的0～3h，细胞中总GSH产量增长迅速，之后增长减缓，在4 h后基本达到平衡。合成前期，胞外GSH含量低，胞内合成的GSH迅速传递到胞外，但细胞外GSH产量随着时间的增长分泌速率降低，随着反应进行，总产量增加缓慢，分泌到胞外的产量也趋于平衡。说明在反应时间4 h时GSH的反馈抑制已形成，为提高GSH的合成量，需减轻GSH的反馈抑制。

图4 渗透细胞酶法合成谷胱甘肽变化规律Fig．4 Change rule of glutathione synthesis by osmotic cells enzyme method

2.3.2 吸附树脂添加时间对合成GSH的影响

GSH的酶法合成随着时间的进行而进行，最终达到平衡，加入树脂的时间不同，吸附的GSH也不同，影响酶法合成GSH的产量。在37℃，160 r/min摇瓶振荡酶法合成GSH反应过程中，添加树脂质量相同的条件下，测定树脂分别在0、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h时添加对GSH合成的影响，其结果如图5所示。

图5 树脂添加时间对合成谷胱甘肽的影响Fig.5 Effect of resin addition time on GSH synthesis

由图5可知，在酶反应进行的0～2.0 h内，随着反应的进行添加树脂，GSH的产量逐渐增加。反应第2.0小时时加入吸附树脂，细胞GSH量（分离出吸附树脂后，细胞内和细胞外GSH量）为498 mg/L，树脂解吸GSH量为246 mg/L，GSH总量达到最大744 mg/L。从图5中树脂解吸量看出，随着时间的增加，树脂解吸量逐渐增大，后趋于平衡。可能是由于前期GSH的合成主要在胞内积累，添加树脂后，树脂吸水膨胀，部分底物被溶解在吸附的水中，降低底物浓度，影响GSH合成，随反应进行，胞内GSH渗透到胞外，通过吸附树脂吸附，促进反应正向进行。2.0 h后添加树脂，由于添加时间晚，未能及时将GSH从反应液中吸附分离，高浓度的GSH产生反馈调节作用，抑制GSH合成酶系活力，且底物与能量被其他生命活动消耗，导致利用率低，使GSH产量有降低。综合考虑，在酶法合成GSH反应进行2.0 h时添加树脂，更有利于酶法合成GSH。

2.3.3 吸附树脂添加量对合成GSH的影响

在37℃、160r/min摇瓶振荡酶法合成GSH反应过程中，在反应进行一定时间后，测定树脂添加量为0、0.5 g/10 mL、1.0g/10mL、1.5g/10mL、2.0g/10mL、2.5g/10mL、3.0 g/10 mL时对GSH合成影响，其结果如图6所示。

图6 树脂添加量对合成谷胱甘肽的影响Fig.6 Effect of resin addition on glutathione synthesis

由图6可知，未添加树脂时，GSH的产量仅为650 mg/L，本试验中，树脂添加量2.0g/10mL，细胞GSH量为448mg/L，树脂解吸GSH量为294 mg/L，GSH最终产量可达742 mg/L，为树脂吸附最佳水平。从图中树脂解吸量看出，当树脂添加量为0～2.0 g/10 mL时，酶反应液中的GSH未被完全吸附，合成的GSH对胞内酶系通过反馈调节影响GSH的产率。继续增加树脂添加量，合成的GSH产量有限，树脂利用率低，解吸过程造成浪费。综合考虑，当GSH的合成产量高于650mg/L时，在酶法合成GSH反应中添加树脂量2.0g/10mL，可高效经济的提高GSH产量。

2.4 前体物质的补加对合成GSH的影响

2.4.1 前体物质的补加量对合成GSH的影响

吸附树脂添加到酶反应液中，及时吸附分离反应液中合成的GSH，降低或解除反应体系的反馈抑制，同时，适当加入前体物质，使胞内反应体系继续进行，GSH产量得到进一步提高。根据上述试验的基础，在添加树脂后一定时间补加初始量20%、40%、60%、80%的前体物质，考察其对GSH产量的影响，结果如图7所示。

图7 前体物质补加量对合成谷胱甘肽的影响Fig.7 Effect of precursor addition on glutathione synthesis

由图7可知，当前体物质补加量较低时，GSH产量随着前体物质补加量的增加而增加，在补加量为前体初始量的60%时产量基本达到最高1136mg/L。继续加大前体物质的补加量，产量增加不明显。说明较低的前体补加量影响GSH合成效率，但随着前体物质持续添加，GSH大量合成，吸附力达到饱和，产生反馈抑制，影响GSH连续合成。综上诉述，选择前体物质补加量为初始量的60%，可加快GSH合成效率，提高GSH产量。

2.4.2 前体物质的补加时机对合成GSH的影响

在上述试验的基础上，在反应2 h、3 h和4 h后对反应液进行前体补加，测量其对GSH合成的影响，结果如图8所示。

由图8可知，较早时间添加前体物质，树脂没有完全吸附GSH，影响或改变了正常的代谢活动，使GSH再次合成受到影响。在3h时进行补加，GSH产量达到最大1148mg/L。再延迟补加时间，树脂吸附饱和，反应继续合成GSH，反馈抑制形成，前体物质得不到有效利用。考虑到操作工艺和生产成本，以及前体物质的添加影响后期GSH含量的测定，选择在添加树脂3 h后补加前体物质，能最大程度提高GSH产量。

图8 前体物质补加时间对合成谷胱甘肽的影响Fig.8 Effect of precursor addition time on glutathione synthesis

2.5 正交试验设计与结果

在上述试验基础上，以不同树脂添加时间、树脂添加量、前体补加量和前体补加时间为自变量，GSH产量为最终指标，设计4因素3水平L9（34）共9个试验点的正交试验，试验设计如表1，试验结果见表2。

表1 合成谷胱甘肽条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for glutathione synthesis conditions optimization

表2 合成谷胱甘肽条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for glutathione synthesis conditions optimization

由表2的试验结果看出，各因素对合成GSH产量的影响不同，其中树脂添加量＞树脂添加时间＞前体添加量＞前体添加时间，合成GSH的最优组合为A1B2C2D2，即树脂添加时间为2.0 h，树脂添加量为2.0 g/10 mL，前体物质添加量为初始量的60%，前体物质补加时间为3 h。为检验试验结果，在上述最佳工艺条件下进行验证试验，经过5次平行试验，实际测得GSH平均产量为1 154 mg/L，与正交试验结果相吻合。

3 结论

本试验进行渗透细胞耦合吸附树脂合成GSH的研究，将酶反应过程与产物分离同步进行，解除或降低GSH对合成酶系的反馈抑制作用，提高GSH产量，简化下游分离纯化过程。研究立足于GSH的性质，在3种不同的吸附树脂中筛选出弱碱性阴离子交换树脂D301作为最优耦合吸附树脂，通过单因素和正交试验对合成工艺进行优化，在酶法合成GSH实验中，反应2.0h添加2.0g/10mL弱碱性阴离子交换树脂D301，反应3 h后补加60%初始量的前体物质，GSH终产量可达1 154 mg/L，比原来提高77.5%。但目前渗透细胞耦合吸附树脂合成GSH还处于实验室阶段，吸附树脂与细胞分离困难，且干扰前体物质的吸收。如何解决吸附树脂的这些问题，是耦合树脂合成GSH的关键，也是进一步研究的方向。

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Effects of coupled adsorption resin on enzymatic synthesis of glutathione by cell

WAN Weijian,DUAN Chao,SUN Yiran,DUAN Xuehui*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China）

The resin suitable for the separation of glutathione was screened from three kinds of adsorption resins by static adsorption-desorption experiments,the resin was coupled with yeast permeation cells,and enzymatic synthesize of glutathione was conducted by precursor addition.Results showed that the adsorption effect of resin D301 was the optimal among the three resins.The processing conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments,in the enzymatic synthesis of glutathione experiments,adding resin 2.0 g/10 ml after reaction 2.0 h,and adding 60%initial concentration of precursor after reaction 3.0 h,finally the glutathione yield was 1 154 mg/L,which increased 77.5%compared with the method without resin and precursor addition.

glutathione;resin;enzymatic synthesis;adsorption

TQ920.1

0254-5071（2017）12-0051-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.011

2017-10-12

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题（SKLF-TS-201113）

万伟建（1991-），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：段学辉（1958-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。