低盐腐乳生产过程及加工环境中的微生物分析

喻世哲，范 熠，韩北忠，陈晶瑜*

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

低盐腐乳生产过程及加工环境中的微生物分析

喻世哲，范 熠，韩北忠，陈晶瑜*

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

腐乳是中国传统发酵食品的典型代表，其生产过程多为开放式生产，微生物的动态变化影响着产品的品质和风味。该研究通过对车间空气、主要接触面以及低盐腐乳生产过程中原辅料、半成品和成品取样，采用传统培养及微生物计数的方法，进行了微生物的动态监测和分析。结果表明，夏季汤料车间菌落总数为4.53 lg（CFU/m3），冬季白坯车间菌落总数为4.48 lg（CFU/m3）；主要接触面的微生物在冬季的菌落总数较夏季略低，白坯造型工序工人的手表面检出较多的大肠菌群。确定了大豆、生产用水、白坯、前酵和灌汤为影响低盐腐乳微生物产生的关键工序，煮浆、盐腌、后酵工序可降低半成品及成品中的微生物数量，对保证低盐腐乳的卫生质量和安全起着关键性的作用，确定了低盐腐乳生产过程中微生物的动态变化及主要来源。

低盐腐乳；生产过程；微生物；加工环境

腐乳是我国传统的大豆发酵食品，风味独特，营养丰富，具有抗氧化、降胆固醇、抗老年痴呆等生理功能[1]。然而，市售腐乳的盐含量在6.2%～14.8%[2]，但高盐含量不但对人体健康有害，而且腐乳的抗氧化性和抑制血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制能力都会降低[3]。近年来我国腐乳行业开发了低盐发酵工艺，生产了食盐含量低至5%的低盐腐乳。但降低盐含量可能会引起腐乳质构松散，易腐败变质，引起安全问题[4]。并且，腐乳是开放式生产，大多为传统的手工操作，加工过程容易引入各种环境微生物[5-7]。因此，在发展低盐腐乳生产新工艺的同时，更加需要对产品加工过程中引入的微生物进行监测[8]。

目前，我国的腐乳发酵通常采用丝状真菌，如毛霉、根霉、米曲霉等。也有生产细菌型腐乳，如藤黄微球菌（Micrococcus luteus）发酵的黑龙江克东腐乳、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵的武汉腐乳。邹家兴等[6]采用16S rDNA-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）序列分析技术分析了腐乳生产过程中的微生物群落结构，结果发现腐乳中的微生物有乳杆菌属、不动杆菌属、链球菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属和肠球菌属等。HAN BZ等[2]检测了腐乳生产过程中总好氧性菌、蜡样芽孢杆菌、肠道菌群、细菌芽孢孢子、霉菌和酵母菌的变化，对我国腐乳的微生物安全性进行了全面的探究。FENG Y等[7]采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电⒕（polymerase chainreaction-denaturing gradientgelelectrophoresis，PCR-DGGE）的方法研究了克东腐乳的细菌群落结构，发现了鸟肠球菌、粪肠球菌、肉葡萄球菌为优势菌群，以及肠膜明串珠菌、腐生葡萄球菌、玫瑰考克氏菌、克氏库克菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等其他细菌。

本研究通过对低盐腐乳加工过程中车间空气、主要接触面以及生产过程中的原辅料、半成品和成品中微生物进行检测，了解低盐腐乳生产过程中微生物的来源和分布特性，确定影响引入微生物的关键环节和相关控制措施，以期为保障低盐腐乳的品质和制定提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低盐腐乳生产过程中的原辅料、半成品和成品：中国北方某腐乳生产企业；琼脂、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基、乳酸细菌培养基（MRS）、结晶紫中性胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基（brilliant green lactose bile broth，BGLB）：北京奥博星生物技术有限公司；Baird-Parker琼脂平板、冻干兔血浆：北京陆桥技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9052电热恒温培养箱、DHG-9053A烘箱：上海一恒科学仪器有限公司；ZDZX-40B1压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ZG720EA4-S微波炉：广东美的微波炉制造公司；MS2-Minishaker涡旋震荡仪：德国IKA公司；SPS202F分析天平：梅特勒-托利多称重设备有限公司；TY-CJ-2ND超净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；XSP-M生物显微镜：重庆光学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 腐乳生产工艺流程及采样点

大豆→浸泡→磨浆→豆浆→加热凝固→划块→白坯→接种毛霉→毛坯→腌制→盐坯→配料装瓶→后酵→腐乳

根据腐乳的生产工艺[8]，选择腐乳生产过程中的4个车间空气，操作过程中的主要接触面，以及生产过程中的夏季和冬季主要生产工序进行取样，研究微生物的变化情况。2014年的7月（夏季）和2015年1月（冬季）分别对腐乳工厂车间空气（白坯车间、毛坯车间、腌坯车间、汤料车间）、主要接触面（切刀、榨板、传送带、包布、毛坯屉、工人的手表面）、主要生产工序中的原辅料、半成品和成品（原料大豆、生产用水、汤料、熟浆、白坯、前酵24 h和48 h毛坯、盐坯、后酵10 d、30 d、50 d的样品）进行采样。

1.3.2 车间空气采样方法

参照GB/T 18204.1—2000《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》[9]中自然沉降法，采集车间空气中的微生物。

1.3.3 接触面采样方法

参照GB 1579—2002《一次性使用卫生用品卫生标准》[10]附录E的涂抹测试法，采集车间主要接触面的微生物。将经灭菌的内径为5 cm×5 cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10 mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

1.3.4 原辅料、半成品和成品采样方法

液体样品：采样前均质搅拌液体，用采样管吸出250mL液体，置于灭菌的三角瓶内，采样过程需确保容器口不被污染；颗粒和块状样品：采用无菌手套，随机抽取250 g样品，装于无菌真空袋中真空封口。样品采集后放入装有冰袋的保温箱中，快速运回实验室检测，一般不超过3 h。

1.3.5 微生物计数

菌落总数的测定参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[11]进行；霉菌和酵母菌的测定参照GB 4789.15—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母菌计数》[12]进行；乳酸菌的测定参照GB 4789.35—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[13]进行；大肠菌群的测定参照GB4798.3—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[14]进行；金黄色葡萄球菌的测定参照GB 4789.10—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》[15]进行。

1.3.6 数据处理

试验重复测定3次，应用SPSS 16.0软件分析，用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），以Tukey范围检验（Tukey′s range test）。实验结果以均值±标准差（X±SD）表示，P＜0.05时表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 车间空气中微生物检测结果

低盐腐乳生产车间空气中的微生物可沉降在食品上，因此空气中的微生物对腐乳的生产过程中的微生物菌群组成和产品质量有较大的影响[16]。夏季和冬季腐乳厂不同车间空气的微生物检测结果如图1所示。

由图1A可知，夏季车间空气洁净程度为：汤料车间＜白坯车间≈毛坯车间＜腌坯车间，汤料车间菌落总数显著高于其他车间（P＜0.05），为4.53 lg（CFU/m3），可能与该车间是一个半敞开体系、尘埃多、湿度大、空间无消毒设施等有关。这与张伟伟[17]研究结果不同，其研究发现空气洁净程度为：盐坯车间＜汤料车间＜毛坯车间＜白坯车间，分析可能与生产地点和工艺不同有关。冬季白坯车间空气中微生物较多，菌落总数为4.48 lg（CFU/m3），较夏季上升了约0.6 lg（CFU/m3）。其次为腌坯车间，汤料车间和毛坯车间较低，分别为3.14 lg（CFU/m3）和2.85 lg（CFU/m3），与其他车间差异显著（P＜0.05）。大肠菌群和金黄色葡萄球菌在所有车间中均没有检出，腐乳生产过程中白坯的加工操作都暴露于空气中，因此不仅要合理调整车间布局，更要定期对车间进行消毒处理[18-19]。

图1 夏季（A）和冬季（B）车间空气微生物检测结果Fig．1 Detection results of microorganism from workshop air in summer（A）and winter（B）

由图1B可知，冬季毛坯车间空气中霉菌和酵母菌数较高，为4.81lg（CFU/m3），显著高于其他车间（P＜0.05）。结合具体生产现场来看，可能是由于车间的面积较大，空气流动性差，伴随着白坯接种毛霉，并且进行前期发酵，真菌孢子飞散到空气溶胶中，导致空气中真菌数量丰富[20]。而白坯车间温度较高，这一生产环节中工人的劳动强度较大，车间内使用风扇降温，以便适合工人作业。所以白坯车间内空气流通性相对较大，真菌数量最少，为2.92lg（CFU/m3）。而夏季白坯车间空气中霉菌和酵母菌数较高，为4.10lg（CFU/m3），较冬季上升了约1.18 lg（CFU/m3），可能与温度变化有关。夏季仅在白坯车间检出乳酸菌，冬季白坯车间乳酸菌数为4.69lg（CFU/m3），其余3个车间乳酸菌数都在2.5lg（CFU/m3）左右，白坯车间明显高于其他车间，同菌落总数结果一致。金黄色葡萄球菌和大肠菌群在所有车间均未检出。

2.2 主要接触面微生物检测结果

在低盐腐乳的加工过程中，直接接触食品的加工设备、器具和工作人员的手也是微生物的重要来源，会对微生物菌群组成造成一定影响。夏季和冬季低盐腐乳生产过程中主要接触面微生物检测结果如图2所示。

由图2可知，总体上，主要接触面的微生物分布在夏季和冬季呈现出相同的规律，冬季的总体微生物菌落数较夏季略低，推测与环境温度变化有关。在六个主要接触面中，包布和切刀的微生物数量最少，传送带、毛坯屉以及夏季的榨板微生物检出较多。可能与榨板和传送带反复使用，清洗不及时有关。无论夏季还是冬季毛坯屉菌落总数均较多，并检出大肠菌群。可能是由于毛坯屉中会残留碎豆花渣，虽然在使用后进行清洗，但是可能与操作人员卫生存在问题以及使用过程中接触面的清洗消毒不彻底有关。因此，毛坯屉、传送带、榨板要作为重点监控对象，生产结束后首先要及时清除设备和器具上黏附的豆渣、豆花碎片等固体残渣及油污，然后彻底清洗消毒。本研究主要监测了白坯造型工序中工人的手微生物数量，夏季菌落总数达到3.62lg（CFU/cm2），并且冬季检出的大肠菌群2.46lg（CFU/cm2）。可能与该工序的工人频繁接触传送带和搬运毛坯屉有关。夏季榨板真菌总数最高，为4.35lg（CFU/cm2）。切刀和包布真菌数量最少，分别为2.63 lg（CFU/cm2）和2.61lg（CFU/cm2），显著低于其他设备和器具（P＜0.05）。夏季乳酸菌在切刀和包布并未检出，工人的手乳酸菌数为2.53 lg（CFU/cm2），其余均在3.8 lg（CFU/cm2）左右。冬季仅有榨板和包布中乳酸菌数下降，其余设备和器具均有不同程度上升。无论冬季和夏季在主要接触面中均未检出金黄色葡萄球菌。

图2 夏季（A）和冬季（B）主要接触面微生物检测结果Fig．2 Determination results of microorganism from major contact surface in summer（A）and winter（B）

2.3 主要生产工序微生物检测

低盐腐乳加工过程中各工序微生物的动态变化可以大致反⒊各个工序中微生物的分布情况，夏季和冬季腐乳厂主要生产工序微生物检测结果见表1。

表1 夏季和冬季腐乳主要生产工序微生物情况Table 1 Microbial community composition during the production of sufu in summer and winter lg（CFU/g）

由表1可知，原料大豆菌落总数较高，在4.8 lg（CFU/g）左右，霉菌和酵母菌数基本保持3.7 lg（CFU/g）水平。据此可见，大豆原料本身微生物较多。主要是因为大豆直接从土壤中收获表面附着泥土，再加上运输和堆放，使得携带大量微生物[21-22]；生产用水菌落总数较高，夏季和冬季分别为2.46 lg（CFU/mL）和2.16 lg（CFU/mL）。 何江等[23]在豆干加工过程中同样发现大豆和生产用水菌落总数较高，分别5.45 lg（CFU/g）和4.34 lg（CFU/g）。因此，大豆和生产用水等原料可能是低盐腐乳生产过程中微生物的主要来源之一。而经过蒸汽加热煮制后，熟浆中菌落总数比大豆少了50%，真菌少了25%左右，乳酸菌少了15%。高温处理使生浆中的大部分杂菌杀灭。由此可知，煮浆工序对灭菌，保证产品的卫生起到了重要作用。煮浆至接种之间的各个工序中，由于没有高温处理措施，因而白坯的菌落总数较熟浆显著上升（P＜0.05）。主要是因为熟浆要经过过滤除渣再点卤，由于滤布和凝固剂不做灭菌处理，可能将微生物引入熟浆[24]；压榨后白坯需要剥去包布，倒入榨板置于传送带上，等待机械造型，此过程中由于传送带和造型机的微生物和空气及堆叠过程中微生物会逐渐繁殖，导致白坯菌落总数增加至4.2 lg（CFU/g）左右，乳酸菌也显著上升。卜宇芳等[25]同样发现在卤豆干生产过程中白坯菌落总数达到5.07 lg（CFU/g），分析其可能来源于压榨设备、烘烤模具和传送带。

毛坯阶段由于白坯接种了毛霉，真菌总数显著上升（P＜0.05）夏季8.93 lg（CFU/g），冬季8.14 lg（CFU/g），夏季高于冬季，这是由于夏季温度高、湿度大，适合真菌的繁殖。伴随着毛霉的大量生长，其他杂菌也随之繁殖，菌落总数和乳酸菌均达到8.0 lg（CFU/g）以上。随着毛坯培养时间的延长，大部分微生物数量显著上升（P＜0.05），在前期发酵48h后达到最大。经过加盐腌制后，抑制或杀死了部分不耐盐菌的生长，因此盐坯中各类微生物均有所减少，其中真菌较为明显，可见食盐对真菌有较强的抑制作用，这与曹翠峰[26]研究结果一致。汤料中细菌总数达到6.64lg（CFU/mL），说明加入汤料时也会带入一定的杂菌。

后期发酵阶段，由于腌坯阶段含盐量较高以及汤料中的酒精和红曲，抑制了微生物的生长[27-28]。后酵10 d后腐乳中的菌落总数、真菌总数、乳酸菌数较盐坯显著下降（P＜0.05）。随着发酵时间的延长，除乳酸菌外，大部分微生物数量呈下降趋势。后酵50 d后菌落总数在7.0 lg（CFU/g）左右，冬季高于夏季，这与真菌总数结果一致，但与徐海蒂等[29]研究结果不一致，其仅在毛坯时和一周不添加乙醇的样品中检出霉菌和酵母菌。在夏季后酵过程中，乳酸菌数呈稳定的上升趋势，冬季乳酸菌数显著下降（P＜0.05），仍达到4.0 lg（CFU/g）以上。说明低盐腐乳中较低的盐含量并不能充分抑制乳酸菌的生长。有研究指出[7]，在一些没有任何腐败迹象的市售白腐乳中，发现了较高水平的乳酸菌（＞106（CFU/g））。乳酸菌在不同的产品中有较大的差异，可能与一些特殊产品的生产工艺不同有关。

除了在前酵和盐坯中有大肠菌群检出外，其他阶段均未检出。其中毛坯中大肠菌群较多，为5.90 lg（CFU/g）和4.33 lg（CFU/g）。经过加盐腌制后，大肠菌群显著下降（P＜0.05）。并且随着汤料的加入和后酵过程的进行，大肠菌群不再检出。金黄色葡萄球菌在不同阶段的原料、半成品和成品中均未检出，说明在低盐腐乳生产过程中对于金黄色葡萄球菌的控制较好。

3 结论

本研究检测了腐乳生产车间空气、主要接触面以及生产过程中的原辅料、半成品和成品中微生物，结果表明，榨板、传送带、毛坯屉、操作人员和车间环境容易在低盐腐乳中引入微生物。夏季车间空气微生物数量为：汤料车间＞白坯车间≈毛坯车间＞腌坯车间，汤料车间菌落总数为4.53 lg（CFU/m3）。冬季车间空气微生物数量为：白坯车间＞汤料车间＞毛坯车间＞腌坯车间，白坯车间菌落总数为4.48 lg（CFU/m3），白坯造型工序工人的手表面检出大肠菌群，需加强加工设备与器具的清洁消毒工作及工人的个人卫生监管。确定了大豆、生产用水、白坯、前酵和灌汤为影响低盐腐乳微生物产生的关键工序。由于暴露在白坯车间中和工作人员流动频繁，大豆和白坯真菌检出较多。煮浆、盐腌、后酵工序可降低半成品及成品中的微生物数量，对保证低盐腐乳的卫生质量和安全起着关键性的作用。

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Analysis of microorganism during the production and processing environment of low-salt sufu

YU Shizhe,FAN Yi,HAN Beizhong,CHEN Jingyu*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

Sufu is a typical Chinese traditional fermented food,and its production process is mostly open production.Dynamic changes of microbes affect the quality and flavor of the products.The microbes from workshop air,major contact surface,raw materials,semi-finished products and finished products during the manufacturing process of low-salt sufu were monitored dynamically and analyzed by the traditional culture and microbial counting methods.The results showed that the total plate count in the dressing-mixture workshop in summer was 4.53 lg （CFU/m3）,and in the pehtze workshop in winter was 4.48 lg （CFU/m3）;The total plate count of microbes from major contact surface in winter was slightly lower than that of in summer,and a large number of coliform bacteria were detected from the hands surface of the workers in the pehtze-making process.The soybean,production water,pehtze,pre-fermentation and dressing mixture were determined as the keyprocesses affecting the microorganism compositions in low-salt sufu.Boiling pulp,salting,post-fermentation process could reduce the number of microbes in semi-finished products and finished products.The research played a key role in ensuring the quality and safety of low-salt sufu,and determined the dynamic changes and major sources of microbes during the manufacturing process of low-salt sufu.

low-salt sufu;production process;microorganisms;processing environment

TS207.4

0254-5071（2017）12-0018-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.005

2017-09-22

“十二五”国家863计划现代农业技术领Ⅱ项目（2013AA102105-4）

喻世哲（1992-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。

*通讯作者：陈晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物学。