槐角提取物中槐角苷的含量测定研究*

刘金香 潘五九 王伟明 董 坤 姚 琳

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

·方药研究·

槐角提取物中槐角苷的含量测定研究*

刘金香 潘五九**王伟明 董 坤 姚 琳

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

目的：建立槐角提取物中槐角苷的含量测定方法。方法：采用Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈-0.07%磷酸水溶液（25:75）；流速1.0mL/min；检测波长260nm；柱温：30℃；进样量：10μL。结果：槐角苷进样浓度在1.502～300.400μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为：Y=4807X+2870（r=0.9999）,平均加样回收率为101.50%，RSD为1.45%。结论：所建立的方法简单可行，重复性好，可用于槐角提取物中槐角苷的含量测定。

槐角 提取物 槐角苷 含量测定 高效液相色谱法

槐角为豆科植物槐（Sophorajaponica L.）的干燥成熟果实，性苦、寒 ，具有清热泻火，凉血止血功效[1]。槐角中含多种黄酮类和异黄酮类化合物，其中槐角苷是槐角的主要活性成分之一[2]。现代研究表明槐角苷具有抗炎、抑制免疫、抗生育和雌激素样等作用[3-4]。我院通过前期的试验研究，分离纯化出槐角提取物，其主要成分为槐角苷。目前，对于槐角药材中槐角苷[5-7]含量测定研究较多，而槐角提取物中的槐角苷的含量测定研究尚未见报道，为有效控制槐角提取物质量，本实验以所在科研课题为支撑，通过HPLC方法测定槐角提取物中槐角苷的含量，为槐角提取物的开发利用提供实验依据。

1 材料

岛津2010LC高效液相色谱仪，SPD-10AVvp检测器（岛津）；Sartorius BSA224S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），Sartorius BP211D电子天平（上海精密仪器有限公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。槐角苷对照品（中国食品药品检定研究院购买，批号为111695—200501）；槐角提取物（自制，批号为20110901,20010902,20110903），乙腈、甲醇、磷酸为色谱级，其余试剂均为分析纯，水为哇哈哈纯净水。

2 方法及结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5µm)；流动相：乙腈–0.07%磷酸水溶液（25:75）；流速：1.0mL/min；波长：260nm；柱温：30℃；进样量：10µL。理论板数按槐角苷峰计算应不低于5000。样品中槐角苷峰与相近峰达到基线分离，分离度良好。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取槐角苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含300.400µg的溶液，作为对照品储备液。精密吸取该储备液1ml，置于10ml容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入70%乙醇40ml，超声处理（功率300W，频率40kHz）15分钟，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液1ml置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 专属性试验

取上述对照品溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别进样10ul，得到对照品、供试品色谱图，见图1、图2。样品中槐角苷峰与相近峰达到基线分离，分离度良好。

图1 槐角苷对照品色谱图

图2 供试品溶液色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 分别精密吸取上述对照品储备液 0.25，0.50，2.50，5.00，12.50ml置 50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得系列标准溶液，依次精密吸取系列标准溶液和对照品储备液各10μl，按上述色谱条件测定峰面积，以槐角苷峰面积作为纵坐标，以槐角苷质量浓度（μg/mL）为横坐标进行线性回归，得到回归方程为Y=4807X+2870，r=0.9999，表明槐角苷质量浓度在1.502～300.4μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.2 仪器的精密度试验 取同一份槐角苷对照品溶液适量，按上述色谱条件，连续进样6次，测定槐角苷峰面积，计算相对标准偏差（RSD）值为0.13%，结果表明该方法下仪器的精密度较好。

2.4.3 稳定性试验 按2.2.2项下方法制备供试液，分别于0、1、2、4、6、8进样，测定槐角苷峰面积，计算其峰面积相对标准偏差（RSD）为0.23%，表明样品溶液在8h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 同一批号供试品，按2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件依次操作，测定槐角苷峰面积，其RSD为0.49%，结果表明该方法重现性较好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知槐角苷含量的供试品约10mg（批号20110901），共6份，精密称定，分别精准加入等量的槐角苷对照品，按2.2.2项下方法制备槐角提取物供试品溶液，按2.1项下色谱条件对样品进行测定，计算平均回收率及RSD。测得结果见如下表1。

表1 槐角提取物中槐角苷加样回收率试验结果（n=6）

2.5 样品测定

三批样品，按照2.2.2项下方法，每个批号平行制备两份供试品溶液，按2.1项下色谱条件，每份供试品溶液重复测定两次。结果样品中槐角苷的含量的平均值分别为79.06%，79.59%，80.23%。

2.6 耐用性试验

考不同流速（0.8,0.9,1.0,1.1,1.2mL/min），不同柱温（25,30,35,40℃），不同色谱柱（Diamonsil C18,Agilent Excend C18）下色谱峰分离度和柱效的变化，结果，分离度和柱效无明显变化，表明此方法的耐用性良好。

3 结果与讨论

3.1 供试品制备方法

参考相关文献[8]中供试品溶液制备方法，分别对提取溶剂(甲醇，不同浓度乙醇)、超声提取时间（10、15、20、30、45min）进行考察，确定最优提取条件为70%乙醇，超声提取15min。

3.2 流动相的选择

参考相关文献[1,9,10]中槐角苷含量测定方法，考察了甲醇-乙腈-0.07%磷酸水，甲醇-0.07%磷酸水，乙腈-0.07%磷酸水系统，经多次实验发现，乙腈-0.07%磷酸水（25:75），目标峰保留时间适中，且色谱峰峰形对称性良好，因此，确定流动相组成及比例为乙腈-0.07%磷酸水（25:75）。

综上所述，本实验所建立槐角提取物的含量测定方法，简单易行，结果准确，重复性好，能够有效控制槐角提取物的质量，并为该提取物的质量标准的建立提供科学依据。

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2013哈尔滨市科技攻关项目（2013AA3BS040)

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