靶细胞萃取联用UPLC/Q-TOF-MS方法分析川芎中的药效成分△

谢佳宾，王媛，田梦，李亚梅，武媛媛，王玉明，李遇伯*，张艳军

(1.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；2.天津中医药大学 天津市现代中药重点实验室，天津 300193)

·基础研究·

靶细胞萃取联用UPLC/Q-TOF-MS方法分析川芎中的药效成分△

谢佳宾1，王媛1，田梦1，李亚梅1，武媛媛1，王玉明1，李遇伯1*，张艳军2*

(1.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；2.天津中医药大学 天津市现代中药重点实验室，天津 300193)

目的建立靶细胞萃取联用UPLC/Q-TOF-MS技术分析川芎中药效成分的方法。方法选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为靶细胞，萃取川芎中的药效成分。在细胞对数生长期加入川芎供试品溶液，孵育2 h收集细胞并用液氮迅速冷冻，反复冻融使细胞破碎，离心得到萃取药物后的细胞样品。采用UPLC/Q-TOF-MS对其进行检测，分析川芎化学成分中与细胞结合的物质，即川芎中与细胞结合进一步发挥药效的可能有效成分。结果从川芎中筛选到2个可能的药效成分，分别为阿魏酸和藁本内酯。结论本研究建立的方法可以通过化合物与细胞中靶点(受体、通道、酶等)之间的特异性结合作用，筛选出川芎中药效活性成分，从而为药物活性成分的筛选以及药物机制的研究提供思路，同时推动了中药安全性的快速发展。

川芎；靶细胞萃取；藁本内酯；阿魏酸；UPLC/Q-TOF-MS

川芎为伞形科植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，其味辛性温，具有活血行气、祛风止痛功能，用于胸痹心痛、胸胁刺痛、跌扑肿痛、月经不调、经闭痛经等[1]。中药化学成分极其复杂，在药材质量控制过程中阐明药效物质已成趋势，因此，明确中药药效成分是保证中药材及其产品安全有效和质量稳定可控的基础与核心。

靶细胞萃取法是一种细胞色谱法[2]，原理是利用生物活性物质的特异性相互作用进行生物样品分离分析和生物活性参数测定，通过药物与靶点(受体、通道、酶等)结合的原理，将药物中的效应物质分离，该类技术具有色谱高效分离分析的优势和以生物活性靶标进行特异筛选的特点，无需分离得到纯品即可快速、高效、简捷地完成活性成分的筛选[3-4]。因此，本研究将靶细胞萃取与分析技术相结合，以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为作用对象，联用UPLC/Q-TOF-MS技术建立了川芎药效成分的筛选方法。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

川芎(购自北京鹤延龄中药饮片公司，批号：150200431)，藁本内酯(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-1432414，质量分数大于99%)，阿魏酸(中国食品药品检定研究院，批号：MUST-110773-201313，质量分数大于99%)，乙腈(美国Sigma公司，色谱纯)，95%乙醇(天津市广成化学试剂有限公司，分析纯)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，HUVEC(天津赛尔生物技术有限公司)，胰蛋白酶(美国GIBCO BRL)，DMEM培养基(美国GIBCO BRL)，1640培养基(美国GIBCO BRL)，胎牛血清(FBS，美国GIBCO)，DMSO(天津市化学试剂一厂)，96孔培养板(比利时Orange Scientific)。

1.2 仪器

Waters Acquity UPLC仪、Waters Xevo G2 Q-Tof/MS质谱仪(美国Waters公司)，十万分之一BT 125D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，HH-S8数显恒温水浴锅(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)，DZTW型电子调温电热套(山东省永兴仪器厂)，CO2恒温培养箱(美国Thermo Forma)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS)，TS-1型摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，5415D型离心机(德国Eppendorf)，ELx800酶标仪(美国Bio-tek)，MTT(美国Ameresco公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为水(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脱(0～2 min，1%～1%B；2～5 min，1%～6%B；5～15 min，6%～10%B；15～20 min，10%～20% B；20～30 min，20%～40%B；30～36 min，40%～50%B；36～38 min，50%～70%B；38～39 min，70%～99%B；39～41 min，99%～99%B；41～43 min，99%～1% B；43～45 min，1%～1%B)，流速：0.25 mL·min-1，柱温：35 ℃，进样量：10 μL。

2.1.2 质谱条件 超高效液相色谱法耦合到Q-TOF-MS，配备电喷雾电离源(ESI)，采用负离子模式进行扫描分析。MS参数设定如下：干燥气流速为10 mL·min-1，N2温度为350 ℃，雾化器气压为310 kPa，脱溶剂氮气流速为600 L·h-1，锥孔反吹氮气为50 L·h-1，毛细管电离电压为2.1 kV，四级杆扫描范围为m/z50～1000，辅助气体为高纯氮气。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取1.0 g川芎药材于圆底烧瓶中，加入10倍量70%乙醇水溶液回流提取1 h，过滤取上清液，残渣再加入8倍量70%乙醇水溶液，提取1 h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩并冻干成粉末。取粉末500 mg，采用乙腈定容至100 mL，即得川芎供试品溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.3 人脐静脉内皮细胞培养

选用稳定的细胞株HUVEC，用DMEM高糖培养基在培养瓶中培养，培养基中含有10% FBS、1%PS、1%非必需氨基酸，在37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。隔天更换培养基，生长3～4 d后细胞达到融合。用胰蛋白酶(0.25%)-EDTA(1 mmol·L-1)的消化液传代。在倒置相差显微镜下放大200倍观察，选均匀铺满瓶底、排列整齐、胞浆饱满、生长状态良好、均一的细胞供实验用。

2.4 靶细胞萃取川芎中的药效成分

选择处于对数生长期的HUVEC，加入无血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2的条件下孵育0.5 h，弃去无血清的培养基，加入用无血清的DMEM培养基溶解川芎冻干粉配制的500 mg·L-1的供试品溶液，孵育2 h。弃去含药物培养基，用PBS冲洗4次，取1 mL第4次洗脱液备用。收集细胞，并将其置于液氮中急速冷冻10 min，随后取出立即置于37 ℃水浴中融化，重复以上反复冻融操作3次，使细胞破碎，并将其冷冻干燥成粉末。取萃取药物后的冻干样品，分别加200 μL 50%甲醇水溶液溶解样品，涡旋混匀1 min，以4 ℃、13 000 r·min-1离心15 min，移取上清液备用。将第4次洗脱液和细胞破碎液用UPLC/Q-TOF-MS检测。以同样的方法用无血清的DMEM溶液代替药液作为空白细胞的破碎液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 制备川芎供试品溶液，连续进样6次，随机选取20个色谱峰，计算20个色谱峰的峰面积的RSD值，20个色谱峰峰面积的RSD在0.9%～2.2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 平行制备6份川芎供试品溶液，连续进样分析，随机选取20个色谱峰，计算20个色谱峰的峰面积的RSD值，20个色谱峰峰面积的RSD在2.2%～5.3%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 制备川芎供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，随机选取20个色谱峰，计算20个色谱峰的峰面积的RSD值，各色谱峰峰面积的RSD在0.8%～2.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定，所以每批样品保证在24 h内测定。

2.6 靶细胞萃取川芎成分分析

分别对空白细胞破碎液和加入川芎的HUVEC破碎液进行UPLC/Q-TOF-MS分析。图1为空白和加入川芎供试品的HUVEC破碎液的BPI图。通过对比可以看出，相对于空白的细胞破碎液，加入川芎供试品的HUVEC破碎液出现2个色谱峰，分别标号为1和2，说明这两个化合物可能是在HUVEC中有吸收的成分。同时，对川芎供试品的HUVEC破碎液中检测到的2个化合物进行质谱鉴定，从一级质谱图中可以获得各个化合物的分子离子峰，从而确定其精确分子量，推导出分子式，然后从二级质谱中对其获得的碎片离子信息进行结构鉴定。具体的物质信息和断裂规律见表1。

峰1保留时间为17.82 min，准分子离子[M-H]-为m/z193.050 2，分子式为C10H10O4，二级碎片中具有193.050 2[M-H]-，161.022 4[M-H-CH3OH]-，136.980 0[M-H-C4H8]-，133.027 4[M-H-CH3COOH]-等离子碎片，通过与文献报道[5-9]的二级图谱比对后推断其为阿魏酸。

注：A.空白细胞提取液；B.加药细胞破碎液。图1 空白细胞提取液和加药细胞破碎液的BPI图

峰2保留时间为26.40 min，准分子离子[M-H]-为m/z189.091 1，分子式为C12H14O2，二级碎片中具有189.099 1[M-H]-，171.098 2[M-H-H2O]-，161.089 9[M-H-CO]-，153.093 4[M-H-2H2O]-，143.095 8[M-H-H2O-CO]-等离子碎片，通过对比文献报道[5-9]，推测其为藁本内酯。

从鉴定结果可知，加入川芎供试品的HUVEC细胞破碎液中检测到的2个化合物分别为阿魏酸和藁本内酯，因此，可以推断阿魏酸和藁本内酯为可能的药效成分。

表1 阿魏酸和藁本内酯的断裂规律

3 讨论

中药有效成分的筛选是创新性药物研究的源头性工作，但由于中药作用的整体性、中药化学成分和作用机制的复杂性，中药药效物质研究一直进展缓慢，成为制约中药现代化进程的瓶颈之一。现代药理研究发现[10]，某些药物发挥作用的一个重要原因是与细胞膜上的受体、酶、通道等结合或进入细胞内部。所以，能与靶细胞有结合的成分可能为药物的活性成分，针对这些成分进行有目的地分离和药理活性筛选，既避免了大量无活性、无吸收成分的干扰，也不用先对中药中成分进行大量的分离纯化工作，为活性成分不明确的中药药效物质研究提供了新的、快捷、有效的方法，克服了以往先从中药中分离有效部位或单体，再分析其药效，从而避免了成分分离和药效筛选脱节的弊端，其成为中药复杂体系的新的研究策略。

本研究建立了靶细胞萃取联用UPLC/Q-TOF-MS技术分析川芎中的药效成分的方法，结果表明，通过靶细胞萃取方法从川芎中筛选出与之细胞结合的可能的药效成分，即藁本内酯和阿魏酸。本研究建立的筛选药效成分的方法，能保持细胞的正常生理状态下对药效成分进行快速筛选，具有准确、简便、重复性好等优势。因此，本研究为川芎的质量控制和药效评价提供了理论依据，同时为快速筛选中药药效成分提供一种研究思路，并为中药安全性和安全用药提供帮助。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：40-41.

[2] 吕燕妮，钱贻崧，付龙生.靶细胞提取联用HPLC-TOF MS法分析丹红注射液中的活性成分[J].中成药，2015，37(12)：2691-2695.

[3] 赵玲玲，丁鸽，蔡照胜.细胞膜色谱技术在中药活性成分筛选中的研究进展[J].时珍国医国药，2014，25(3)：697-699.

[4] 王磊，王媛，李爱主，等.基于靶细胞萃取的延胡索药效成分的筛选和含量测定[J].药物评价研究，2016，39(6)：990-994.

[5] 左爱华，程孟春，王莉，等.川芎吸收入脑成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中国中药杂志，2012，37(23)：3647-3650.

[6] 王镇方，赵阳，庞旭，等.利用UPLC-Q-TOF-MSn快速分析四物汤中的化学成分[J].中国中药杂志，2013，38(21)：3702-3708.

[7] 徐晓芳，孙东东，李祥，等.川芎水提部位化学成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].南京中医药大学学报，2013，29(4)：382-386.

[8] Li W，Tang Y，Qian Y，et al.Comparative analysis of main aromatic acids and phthalides in Angelicae Sinensis Radix，Chuanxiong Rhizoma，and Fo-Shou-San by a validated UHPLC-TQ-MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal，2014，99：45-50.

[9] Li H X，Ding M Y，LYU K，et al.Determination of the active ingredients in Chuanxiong by HPLC，HPLC-MS，and EI-MS[J].J Liq Chromatogr R T，2001，24(13)：2017-2031.

[10] 董倩倩，李萍，宋越，等.靶细胞提取和高效液相飞行时间质谱联用分析预测丹参中的活性成分[J].分析化学，2007，35(5)：648-652.

AnalysisofPharmacodynamicComponentsinChuanxiongRhizomabyTargetCellSorptionCombinedwithUPLC/Q-TOF-MS

XIE Jiabin1，WANG Yuan1，TIAN Meng1，LI Yamei1，WU Yuanyuan1，WANG Yuming1，LI Yubo1*，ZHANG Yanjun2*

(1.CollegeofTraditionalChineseMateria，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China； 2.TianjinStateKeyLaboratoryofModernChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China)

Objective:To establish a method by using target cell and UPLC/Q-TOF-MS for extraction the pharmacodynamic components in Chuanxiong Rhizoma.MethodsThe human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used as target cells，and the freeze-dried powder of Chuanxiong Rhizoma in logarithmic growth period was added.After 2 h incubation，the cells were collected and frozen rapidly with liquid nitrogen，the cells were broken by repeated freezing and thawing，and centrifuged to obtain a sample of cells after extraction.While compounds in the extract of cell samples were determined by UPLC/Q-TOF-MS，the effect of possible effective components that entered the cell of Chuanxiong Rhizoma was analyzed.ResultsAfter HUVEC extraction two active ingredients ferulic acid and ligustilide were obtained.At the same time，the method was established for the determination of the two components.ConclusionThe analysis method of the target cell extraction and UPLC/Q-TOF-MS can be applied for screening out the active ingredients in Chuanxiong Rhizoma by specific binding effect between the compound and the target (receptor，channel，enzyme，etc.) in the cell，so as to provide a new method for screening the active ingredients and drug mechanism study.

Chuanxiong Rhizoma；target cell sorption；ferulic acid；ligustilide；UPLC/Q-TOF-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.007

国家科技支撑计划课题(2011BAI07B08)

*

李遇伯，副教授，硕士生导师，研究方向：中药分析及代谢组学研究，Tel:(022)59596191,E-mail:yaowufenxi001@sina.com;张艳军，教授，博士生导师，研究方向：中药药理及安全性评价研究，Tel：(022)59596223，E-mail：tianjin_tcm001@sina.com

2017-01-05)