SCN3A 基因突变型表达载体的构建及在 HEK 293 细胞中的表达

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(1.南华大学附属南华医院神经内科,湖南 衡阳 421002;2.深圳市罗湖区人民医院神经内科;3.广州医科大学神经病学研究所)

·基础医学·

SCN3A基因突变型表达载体的构建及在HEK 293细胞中的表达

陈勇军1，邱国真2，汤斌3，刘稀金1，李欣1，何妍妍1

(1.南华大学附属南华医院神经内科,湖南 衡阳 421002;2.深圳市罗湖区人民医院神经内科;3.广州医科大学神经病学研究所)

目的体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV6-XL4-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G)，为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物，以野生型质粒为模板进行定点诱变，构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中，24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后，RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A 基因突变型真核表达载体pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，并在基因水平上验证了能在HEK293 细胞中表达。

SCN3A； 质粒； 表达； RT-PCR

癫痫是以脑部神经元异常高度放电所致的突发和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的综合征，电压依赖性钠离子通道作为神经系统兴奋活动的基础[1]，与癫痫的发生密切相关。在哺乳动物中，已经证实有功能表达的钠通道亚型有9型[2-3]，亚型SCN1A早已明确为热性惊厥相关性癫痫的主要致病基因[4-5]，而SCN3A与癫痫的相关性在近年才逐渐引起人们的关注[6-8]。本文作者对热性惊厥相关性癫痫的病人进行SCN3A基因筛查时发现一例新发突变c.905A>G/p.N302S，该突变位于钠离子通道的孔区，而正常人对照中没有发现相应的突变，与人和哺乳动物各型钠离子通道进行同源比对后发现高度保留，提示可能为致病性突变。为了进一步阐述基因突变后对蛋白功能的影响，如对钠离子通道电生理功能的影响，以探讨基因突变的致病机制，本实验旨在构建SCN3A基因的突变表达载体，并在 HEK293 细胞上验证表达，为深入的功能研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1质粒、菌株、细胞和主要试剂含有正常人SCN3A基因mRNA全长片段的真核细胞表达质粒(pCMV6-XL4-SCN3A)由北京敖锐东源生物科技有限公司(OriGene Technologies，Inc)合成。电转化感受态大肠杆菌菌株(STBL2)购自于Invitrogen公司。HEK293细胞购自中科院上海细胞库。定点诱变试剂盒(Stratagene公司)，EcoR I和Xhol I内切酶、DNA marker、胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，质粒提取试剂盒、转染试剂(德国QIAGEN公司)，DMEM、优等胎牛血清(赛默飞世尔化学制品有限公司)，PCR扩增试剂盒(广州东盛生物制品有限公司)，RNA提取试剂、逆转录试剂(Fermentas公司)，引物合成(上海生工生物工程有限公司)、millipore透析膜(美国密理博公司)。

1.2实验方法

1.2.1 pCMV6-XL4-SCN3A野生质粒鉴定 将pCMV6-XL4-SCN3A全长序列输入软件Primer Genesis中(方法：进入http://primergenesis.com，点击DNA Tools，输入碱基序列，点Restriction Map显示出所有酶切位点，选择合适内切酶，能将该序列切为长短不同的两个以上的便于辨认的片段)，选择EcoR I，Xho I 酶切位点，其中EcoR I有两个酶切位点，能将该质粒切为长短不同的三个片段，依次为：2 514 bp、3 637 bp、7 526 bp。配置双酶切体系：取质粒约150 ng，EcoRI 0.5 μL，XhoI 0.5 μL,10×buffer 1 μL，加ddH2O 到10 μL。37 ℃孵育45 min，使用1%琼脂糖凝胶电泳。选取酶切正确的质粒纯化后送华大基因公司测序，参照文献[9]所列引物测通SCN3A基因编码区全长序列，无碱基改变的质粒作为定点诱导突变的模板。

1.2.2 pCMV6-XL4-SCN3A-N302S突变质粒构建 采用Quick change XL site-directed mutagenesis kit定点诱变试剂盒，按说明书要求设计引物及进行扩增，正反向引物为反向互补，所用引物如下。

SCN3A-N302S-F：5′-GGCACAATGGATTCAAGTGGGACATTTGTTAATG -3′，SCN3A-N302S-R：5′-CATTAACAAATGTCCCACTTGAATCCATTGTGCC -3′。

(1)突变质粒的PCR扩增：反应体系为50 μL，按次序加入ddH2O 37 μL，10× Reaction buffer 5 μL，dNTP mix (10 mM)1 μL，正、反向引物(125 ng/μL) 各1 μL， PfuTurbo DNAPolymerase (2.5 U/μL) 1 μL，pCMV6-XL4-SCN3A 质粒(约20 ng) 1 μL，Quik Solution 3 μL。反应条件为：95 ℃预变性1 min，然后95 ℃变性50 s，60 ℃退火50 s，68 ℃延伸14 min，18个循环，最后68 ℃保温40 min。(2)模板质粒的去除：在上述PCR产物中加入1 μL Dpn I于37 ℃水浴中处理1 h，以除掉母质粒。该步骤的原理是：Dpn I内切酶作用于来自大肠杆菌的甲基化的质粒DNA，而PCR扩增的新质粒DNA没有甲基化，不会被Dpn I内切酶所消化。(3)突变质粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S的克隆：将上述酶切处理的PCR产物透析后，再电击转化STBL2感受态细胞，涂布于LB平板上(含100 μg/mL氨苄青霉素)，30 ℃条件下培养48～72 h，挑取单克隆入LB液体培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，于30 ℃条件下振荡培养36～48 h至液体混浊，提取质粒。

透析过程：取预冷的20% PEG8000透析液2 mL加入小培养皿内，培养皿平放冰上，夹取millipore透析膜一张平放浮于透析液面上，光面朝上，PCR产物小心滴在膜上，透析1 h。

电转化过程：吸取透析剩余液体约5 μL，加入40 μL大肠杆菌STBL2电击感受态细胞中混匀，冰浴3 min。混合液吸入0.1 cm电击杯中，注意避免产生气泡，EcoⅠ模式按压pusle键一次，电击参数为1.75 kV、5.00 ms。电击杯内快速加入500 μL SOC混匀吸出，加入1.5 mLEP管内，然后经37 ℃ 200 rpm振摇1 h复苏后涂板。

(4)pCMV6-XL4-SCN3A-N302S质粒的鉴定和扩增：按QIAGEN质粒提取试剂盒抽提质粒，Ecol I和Xhol I双酶切初步鉴定，电泳条带符合预期的质粒送华大基因公司测序。测序符合c.905A>G而其它位点碱基无变化的质粒为突变成功，留取菌液150 μL加入150 mL LB液体培养基中扩大摇，30 ℃条件下持续振荡培养24 h，提取质粒，经酶切正确者测浓度后放入-20 ℃保存，供后续实验使用。

1.2.3 质粒异源表达的鉴定

(1)细胞培养及转染：以含10%FBS的DMEM高糖培养基培养HEK293细胞，6孔板内接种，待细胞融合近80%时,按照每孔2.0 μg pCMV6-XL4-SCN3A野生型或突变型质粒及15 μL PolyFect Transfection Reagent的比例进行转染。步骤为：按上述比例混合的质粒加入不含抗生素和血清的DMEM 100 μL中，再加入转染试剂15 μL 轻轻混匀，室温静置8 min；吸走培养板内旧液，更换新的含血清和抗生素的培养液，轻轻吸取转染复合物从各个方向均匀滴入板内，小心放入培养箱内继续培养。转染24 h后进行RNA提取。(2)基因水平的表达：参照Thermo Scientific GeneJET RNA Purification Kit说明书步骤提取RNA，测浓度后取2 μL电泳观察RNA条带，条带清楚者进行逆转录反应，逆转录参照RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行，反应产物放置-20 ℃保存。以上述步骤得到的cDNA产物为模板，设计目的基因片段和内参基因片段引物(表1)，扩增相应的片段(目的基因和内参基因片段采用独立的PCR体系扩增，但加入cDNA量相同)，PCR产物各取4 μL用2%凝胶电泳，条带符合预期大小的送华大基因进一步测序验证序列是否正确。

表1目的基因和内参基因片段引物

引物SCN3A基因内参GAPDH基因正向5'CGGAAGTCAGAAAGAGAAGG3'5'CTGGTAAAGTGGATATTGTTG3'反向5'CAAATAGTGATGGCAAGATC3'5'GAAATCCCATCACCATCTTC3'

2 结 果

2.1突变质粒的成功构建

2.1.1 原始质粒与突变质粒的酶切鉴定 pCMV6-XL4-SCN3A质粒大小为13.7 kb(图1A)。EcoR I和Xho I双酶将质粒切为三个片段 ：2.6 kb、3.6 kb和7.5 kb(图1B)。突变质粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S大小不变，上述双酶切位点没有破坏，仍能将质粒切为相应大小三个片段的可能为突变成功的质粒，进一步验证需要测序证实。

图1 pCMV6-XL4-SCN3A质粒模式图 A：及酶切图；B：Marker(DL 500～12000)

2.1.2 原始质粒与突变质粒的测序图 原始质粒编码区全长测序证实未出现突变。突变质粒目标位点(c.905A>G)突变成功，其它编码区全长证实未出现意外突变。质粒突变前后测序峰图对照如下(图2)。

2.2基因表达水平的鉴定提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳显示完整的三条RNA电泳带(5S、18S、28S)。紫外分光光度计测定RNA的260 nm/280 nm吸光度值比为1.8～2.0，浓度为1～2 μg/μL。经逆转录获得cDNA产物。以野生型和突变型质粒的cDNA为模板扩增目的片段，电泳图谱均在约270 bp处出现条带，与预期271 bp大小相符，提示质粒在基因水平上成功表达，片段送测序证实为目的片段序列。各条带右侧为约160 bp的条带，是内参GAPDH片段，与预期158 bp大小相符(图3)。由此表明野生型和突变型质粒在基因水平上都得到了表达。

3 讨 论

SCN3A基因与癫痫相关的报道至今仍然较少，而其致癫痫的机制仍然是探索性的[10]，但是目前报道与癫痫相关的5例SCN3A基因突变都进行了电生理功能研究[6-7]。本文作者在1例癫痫病人中新发现了SCN3A-N302S突变，采用定点诱导突变的方法成功构建了含有突变点的质粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，随后将野生型及突变型质粒转染到HEK293细胞中进行异源表达，在基因水平上得到了验证，提示了SCN3A基因体外表达的细胞模型成功构建。质粒定点诱变的基础为PCR技术，为了保证外源性DNA能够扩增、繁殖，形成大量拷贝，必须与载体连接进入受体细胞后形成一个复制子，即形成能够在细胞内进行自我复制的遗传因子。载体是基因克隆中的一个重要组成部分，缺乏载体的帮助，外源DNA很难进入到受体细胞内，即使能够进入往往也不能复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制控制系统。本文用到的质粒载体，全长4 707 bp，带有巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子等。其中SV40启动子可以使基因在多种哺乳细胞中表达，使外源基因稳定表达成为可能，并且对外源基因的插入片断的长度没有太多限制。pCMV6-XL4载体内插入了长度为8 994 bp的SCN3AmRNA全长，获得的质粒大小在10 Kb以上，扩增的难度加大、碱基错配率提高、成功率下降，Stratagene试剂盒使用了高保真酶进行扩增，高度保证了扩增的忠实性，使得一步法构建质粒操作过程变为可能。为了减少碱基的错配率，反应的循环次数和常规相比明显减少，但是延伸的时间明显延长(延伸14 min，18个循环)。电转化是利用高压电击细胞，使细胞壁和细胞膜瞬间被击穿，形成能通过外源物质的跨膜通道，外源DNA 分子通过该通道进入细胞内[11]。对于大分子质粒，PCR产物经透析后进行电转化极大地提高了转化效率，为基因成功克隆提供了保障。

图2 测序峰图对照 A： 野生型； B：突变型c.905A>G

图3 HEK293细胞SCN3AmRNA条带及基因表达 A：RNA电泳条带； B:野生型和突变型基因目的片段及各自对应的内参片段

综上所述，应用基因定点诱变技术，成功的将含有野生型的SCN3A基因的质粒pCMV6-XL4-SCN3A诱变为突变型的pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，为进一步的基因突变功能研究，如膜片钳电生理功能研究奠定了基础。

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ConstructionofSCN3AgenemutantexpressionvectoranditsexpressioninHEK293cells

CHEN Yongjun,QIU Guozhen,TANG Bin,et al

(DepartmentofNeurology,NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo construct the mutant N302S (c.905A>G) of plasmid pCMV6-XL4-SCN3A containing the SCN3A gene mRNA fragment in vitro,and provide experimental basis for further functional studies.MethodsThe primers with mutation sites were designed and the mutant plasmids were constructed by site-directed mutagenesis using wild-type plasmids as templates.The recombinant plasmid was transiently transfected into HEK293 cells,and the expression of the target gene was verified by RT-PCR after 24 hours.ResultsRecombinant plasmid digestion and sequencing confirmed that the mutation was successful.The expression of the target gene was detected by RT-PCR after transfection of recombinant SCN3A eukaryotic expression plasmid into HEK293 cell line.ConclusionThe SCN3A gene mutant eukaryotic expression vector pCMV6-XL4-SCN3A-N302S was successfully constructed and expressed in HEK293 cells at the gene level.

SCN3A; plasmid; expression; RT-PCR

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.006

2016-10-11；

2016-12-30

湖南省教育厅立项课题资助(15C1206)及衡阳市科技局课题资助(2015KJ59).

R349

A

蒋湘莲)