黑素细胞自噬与老年白癜风患者临床类型的关系

王华清

(日照市皮肤病防治所，山东 日照 276800)

黑素细胞自噬与老年白癜风患者临床类型的关系

王华清

(日照市皮肤病防治所，山东 日照 276800)

目的探讨黑素细胞自噬和老年白癜风患者临床类型的关系。方法选取88例老年白癜风患者，包括41例节段型白癜风患者(节段型组)和47例泛发型白癜风患者(泛发型组)，同时选取健康体检的健康老年志愿者88例为对照组。比较节段型组和泛发型组患者的临床特征，比较节段型组和泛发型组白斑区周围正常肤色部位皮肤和对照组任意部位正常肤色皮肤的黑素细胞诱导前后自噬体数量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ、小眼球畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶相关蛋白(TRPs)相对表达情况。结果节段型组和泛发型组发病年龄、家族史、伴有晕痣和复发率差异无统计学意义(均P>0.05)；节段型组同形反应少于泛发型组(P<0.05)。诱导前节段型组和对照组可见自噬点数目显著多于泛发型组(P<0.05)；诱导后3组自噬点数目较诱导前均显著增多，且泛发型组显著多于节段型组和对照组，对照组显著多于节段型组(P<0.05)。诱导前泛发型组MITF显著高于节段型组和泛发型组，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2均显著低于节段型组和泛发型组；诱导后3组MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1较诱导前均显著升高，且泛发型组MITF、TYR、TYRP1高于节段型组和泛发型组(P<0.05)。结论白癜风患者黑素细胞存在自噬现象，对功能性分子表达产生影响，且泛发型白癜风黑素细胞自噬现象和对功能性分子表达的影响较大。

节段型；泛发型；白癜风；黑素细胞自噬

白癜风根据面积和皮损部位可分为泛发型、节段型和局限型〔1〕。目前白癜风顽固难治，病程长，存在治疗抵抗〔2〕。白癜风可发于任何年龄，但临床上目前对其病因并未明确。已有研究指出〔3〕，自身免疫、遗传、压力、神经假说、自身细胞毒素等均可能诱发白癜风，白癜风的病理特点为皮损处黑素消失，毛囊黑素细胞、表皮基底层黑素细胞缺失或丧失生成功能。自噬是细胞内的“自食”现象，通过溶酶体和自噬内涵体的共同作用对细胞内需要降解的细胞器进行降解，在细胞低于外界能量缺乏、饥饿、应激等不良环境时发挥重要作用，但自噬不足或多度均可能导致机体病变。有学者〔4〕认为黑素细胞自噬缺失与白癜风的发病有密切相关性。本研究旨在探讨黑素细胞自噬与老年白癜风患者临床类型的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月至2017年1月日照市皮肤病防治所收治的88例老年白癜风患者。节段型组41例中男22例，女19例；年龄65～87〔平均(74.27±7.43)〕岁；病程2～36个月，平均(23.11±7.49)个月。泛发型组47例中男26例，女21例，年龄66～88〔平均(73.17±8.26)〕岁，病程2～36个月，平均(22.44±8.43)个月。对照组88例志愿者中男56例，女32例，年龄65～89〔平均(75.28±9.16)〕岁。3组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。纳入标准：①经临床诊断为进展期白癜风；②年龄≥65岁；③治疗前3个月内未接受免疫抑制剂、糖皮质激素、紫外线、光敏剂等治疗；④自愿参加本项研究并已经签署知情书。排除标准：①合并桥本甲状腺炎、斑秃等感染性或自身免疫性疾病者；②合并严重的心、肝、肾、肺功能障碍者；③中途退出研究者。

1.2方法

1.2.1培养黑素细胞 将分离的表皮片放入无菌D-Hank液中漂洗2次，37℃下以0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)和0.25%胰蛋白酶孵育10 min，在10%含血清的F12培养基内加入细胞悬液并吹打5次，1 000 r/min、半径5.5 cm离心5 min。用黑素细胞Hu16选择性培养基吹打成细胞悬液，将细胞浓度调整为5×105个/ml接种在37℃下的培养瓶内，置于5%CO2培养箱内培养3 d后加入(Ceneticin)，将成纤维细胞和角质形成细胞除去，每隔1 d更换1次，当黑素细胞融合达到80%时以0.05%胰酶-EDTA消化黑素细胞，离心后置于F12培养基内待测。

1.2.2观察黑素细胞结构 使用透射电子显微镜对对数生长期黑素细胞进行观察，将细胞密度为1×105个/ml的黑素细胞接种在6孔板上，细胞贴壁后，加入30 nmol/L的雷帕霉素，培养48 h后置于离心管内，固定，染色进行观察，拍照和记录。

1.2.3观察自噬强度 培养对数生长期黑素细胞，将细胞密度调整至1×105个/ml后使用Ad-LC3-GFP-mRFP腺病毒进行2 h感染，更换培养液对其进行36 h培养。加入30 nmol/L的雷帕霉素，培养48 h，使用双荧光微管相关蛋白1轻链3(LC3)细胞自噬腺病毒报告系统和荧光共聚焦显微镜对自噬溶酶体和自噬体数量进行观察和计算，探究细胞中自噬流(Autophagy Flux)强度。

1.2.4免疫印迹检测 加入30 nmol/L的雷帕霉素，培养48 h后常规提取蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将其转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜使用含5%脱脂牛奶的Tris盐酸缓冲液(TBST)封闭，加入兔抗LC3Ⅱ、兔抗小眼球畸形相关转录因子(MITF)、兔抗酪氨酸酶相关蛋白(TYR)、兔抗TYRP1、兔抗TYRP2和鼠抗β-actin单克隆体进行孵育，通过免疫反应条带读取蛋白相对表达水平。

1.3统计学方法 应用SPSS19.0软件行t、χ2检验、方差分析。

2 结 果

2.1节段型组和泛发型组患者临床特征比较 节段型组和泛发型组发病年龄、家族史、伴有晕痣和复发率差异无统计学意义(P>0.05)；节段型组同形反应显著少于泛发型组(P<0.05)。见表1。

2.2诱导前后3组自噬点数目比较 诱导前节段型组〔(8.68±4.33)个〕和对照组〔(10.21±4.33)个〕可见自噬点数目，显著多于泛发型组〔(1.07±0.57)个〕(P<0.05)；诱导后3组均显著增多，且泛发型组〔(33.77±9.49)个〕多于节段型组〔(18.13±5.38)个〕和对照组〔(26.89±7.56)个〕，对照组显著多于节段组(P<0.05)。

2.3诱导前后3组LC3Ⅱ、MITF、TRPs相对表达比较 诱导前泛发型组MITF显著高于节段型组和泛发型组，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2显著低于节段型组和泛发型组；诱导后3组MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1显著升高，且泛发型组MITF、TYR、TYRP1显著高于节段型组和泛发型组(P<0.05)。见表2。

表1 节段型组和泛发型组临床特征比较〔n(%)〕

表2 诱导前后3组MITF、LC3Ⅱ、TRPs相对表达比较

与对照组比较：1)P<0.05；与节段型组比较：2)P<0.05；与诱导前比较：3)P<0.05

3 讨 论

目前临床上对于白癜风的发病机制并未明确，但研究认为白癜风皮损中黑素细胞的丧失可能是导致白斑的主要原因，且细胞免疫反应和自身抗体反应破坏黑素细胞〔5，6〕。黑素生成是需要多种信号通路相互作用的过程，约150种基因与黑素生成过程有关，涉及蛋白激酶A通路、蛋白激酶C通路、MAPK等通路。自噬是细胞内溶酶体和自噬体共同作用对细胞内容物进行降解的过程，研究指出〔7〕自噬相关基因紫外线抵抗相关基因与寻常型白癜风发病有密切关系。

黑素小体是一种溶酶体相关细胞器，对黑素细胞的黑素合成、黑素储存和黑素转运均有较重要作用。研究指出〔8〕，自噬对黑素小体的生成过程有关键作用。LC3Ⅱ是自噬特异性标志物之一，与自噬过程中调控黑素正常生成和清除异常黑素小体等过程有密切相关性，本研究结果说明泛发型白癜风患者体内黑素细胞自噬较易被诱导。MITF是黑素代谢过程中重要的转录因子，在皮肤生成黑素的过程中，对TYR、TYRP1和TYRP2等因子的表达进行调控，并调节黑素细胞的发育、分化等〔9〕。自噬过程通过对黑素小体的降解过程和生成过程进行调节进而控制黑素的生成，此过程中MITF及其转录对网络功能异常进行调节，白癜风黑素细胞的氧化应激反应对微小RNA25过表达产生影响进而减少MITF转录，因而MITF与黑素细胞自噬过程有密切相关性〔10〕。本研究结果说明，泛发型白癜风患者体内自噬点数目较少，但经诱导后自噬点数目显著增多，体现了泛发型白癜风患者对自噬诱导较敏感。同时泛发型白癜风患者同形反应少于节段型白癜风患者，提示在临床治疗中，对于节段型白癜风患者来说，未发生病变的皮肤色素脱失斑出现的可能性较小，应避免因外伤加重病情，避免诱发新发皮损，且不适合进行自体表皮移植手术〔11〕。

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2Karsli N，Akcali C，Ozgoztasi O，etal.Role of oxidative stress in the pathogenesis of vitiligo with special emphasis on the antioxidant action of narrowband ultraviolet B phototherapy〔J〕.J Int Med Res，2014；42(3)：799-805.

3Zeng Q，Yin J，Fan F，etal.Decreased copper and zinc in sera of Chinese vitiligo patients：a meta-analysis〔J〕.J Dermatol，2014；41(3)：245-51.

4杨莉莉，隗 祎，杨 骥，等.白细胞介素-17对人黑素细胞合成黑素功能的影响〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2015；14(4)：215-8.

5Singh A，Kanwar A，Parsad D，etal.Randomized controlled study to evaluate the effectiveness of dexamethasone oral minipulse therapy versus oral minocycline in patients with active vitiligo vulgaris〔J〕.Indian J Dermatol Venereol Leprol，2014；80(1)：29-35.

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7王 芳，林新瑜，刘 刚，等.白细胞介素-23对人表皮黑素细胞生物活性的影响〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2014；13(6)：341-4.

8于 宁，陆家睛，易雪梅，等.TLR3活化对正常人表皮黑素细胞内活性氧簇表达的影响〔J〕.山东医药，2015；55(38)：18-20.

9聂慧琼，王 平.黑素细胞自噬研究进展〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2015；14(6)：397-9.

10田 军，熊祖明，张国辉，等.氧化应激及免疫在白癜风发病中的作用机制进展〔J〕.实用皮肤病学杂志，2015；8(6)：441-5.

11苏远婷，金慧玲，张汝芝，等.黑素瘤的自噬靶向治疗〔J〕.国际皮肤性病学杂志，2014；40(5)：299-302.

R758.4+1

A

1005-9202(2017)23-5912-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.076

王华清(1970-)，女，主治医师，主要从事皮肤疾病研究。

〔2017-10-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)