久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠IL-2、IL-4、IL-10表达的影响

殷银霞 刘永华 刘香玉 李海龙 蔺兴遥 程小丽 梁建庆 吴玉泓

(北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518116)

久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠IL-2、IL-4、IL-10表达的影响

殷银霞 刘永华1刘香玉1李海龙1蔺兴遥1程小丽1梁建庆1吴玉泓1

(北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518116)

目的探讨不同剂量久泻灵颗粒治疗前后脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠血清及结肠中白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10及其基因表达的变化。方法大黄水煎液灌胃+肌注氢化可的松+三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法复建动物模型。90只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、久泻灵颗粒高、中、低剂量组及柳氮磺吡啶(SASP)组，药物干预后，镜下观察病理组织学变化进行评分，采用酶联免疫法检测各组大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10含量，RT-qPCR法检测基因表达。结果相比空白组，模型组大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10含量及结肠组织中的基因表达均降低(P<0.05)；相比模型组，各治疗组大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10含量及结肠组织中的基因表达均升高(P<0.05)，作用最显著的是久泻灵颗粒高剂量组(P<0.05)。结论久泻灵颗粒调节免疫活性，促进脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠血清中IL-2、IL-4及IL-10的分泌，从而抑制炎症发生，保护结肠黏膜。

久泻灵颗粒；溃疡性结肠炎；IL-2；IL-4；IL-10

溃疡性结肠炎(UC)是一种反复发作的慢性非特异性炎症性肠病(IBD)，其病因尚不明确，目前多认为与自身免疫密切相关〔1〕。中医学中将本病归属于“久痢”范畴〔2〕。脾肾阳虚型UC在临床最常见〔3〕。久泻灵颗粒以四神丸合理中丸为主方，功效温补脾肾，针对脾肾阳虚证型。文献报道指出，白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10作为抑炎因子在UC发病中表达明显降低〔4,5〕。本研究拟分析久泻灵颗粒在治疗脾肾阳虚型UC中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 甘肃中医药大学实验动物中心提供的体质量(170±20)g的SPF级Wistar大鼠 90只，雌雄各半，鼠龄5～7 w。实验动物质量合格证〔SCXK(甘)2015-0002〕，实验动物设施使用证明〔SYXK(甘)2015-0005〕。

1.1.2药品、试剂及主要仪器 大黄水煎液(甘肃中医药大学附属医院)，氢化可的松注射液(国药集团容生制药有限公司，批号1406418-A11)，三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma 公司，批号SLBP08899V)，久泻灵颗粒(补骨脂∶人参∶干姜∶炒白术∶炙甘草∶五味子∶肉豆蔻∶吴茱萸=4∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶1，甘肃省众友健康医药股份有限公司)，柳氮磺吡啶肠溶片(上海信谊天平药业有限公司，批号09141010)，IL-2、IL-4、IL-10基因上下游引物(大连宝生物公司合成)，反转录试剂盒(Promega 公司，批号0000187427)，PCR扩增试剂盒(Promega 公司，批号0000190991)，IL-2酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号R160506-001a)、IL-4 ELISA试剂盒(批号R160506-002a)、IL-10 ELISA试剂盒(批号R160506-004a)购自鑫博盛生物制剂有限公司。Benchmark Plus连续波长酶仪(美国Bio-rad)、冷冻高速离心机(Biofuge-Stratos)、Bio-Rad 荧光定量PCR仪(CFX96)。

1.2方法

1.2.1分组与造模 90只SPF级Wistar大鼠，适应性喂养7 d，按雌雄及体重根据随机数字表法分为6组，每组15只。大黄水煎液灌胃+肌注氢化可的松+TNBS/乙醇灌肠法〔6,7〕复制脾肾阳虚型UC大鼠模型，除空白组以外，其余大鼠每日上午给予大黄水煎液灌胃，下午给予蒸馏水灌胃，2 ml/只，共14 d，造成脾虚模型；空白组大鼠给予等体积蒸馏水。在此基础上，除空白组以外，其余各组第15天开始在大鼠、左右肢臀部每日交替肌注氢化可的松，25 mg/kg，共10 d，造成脾肾阳虚模型；第25天不禁水禁食，第26天采用100 mg/kg TNBS混合50%乙醇灌肠。空白组给予等体积蒸馏水灌肠，完成造模。

1.2.2给药方法 造模后第2天开始药物干预灌胃，1次/d。久泻灵颗粒高、中、低剂量组每日分别以13.500、6.750、3.375 g/kg的生药剂量进行灌胃(通过体型系数换算大约为正常成人剂量的10、5、2.5倍)，柳氮磺吡啶(SASP)组按0.2 g/kg剂量灌胃，空白组、模型组生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 ml/kg，共21 d。

1.2.3标本采集及处理 各组大鼠于造模21 d末不禁水禁食24 h，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，-80℃保存，剖腹截取大鼠整个结肠组织纵轴剪开，反复用生理盐水清洗干净，装入标记的冻存管中，-80℃保存，大鼠尸体交于科研实验动物中心无害化处理。

1.2.4指标监测

1.2.4.1结肠炎症评价 各组大鼠结肠黏膜大体形态学评分参照Strober标准〔7〕，结肠组织进行苏木素-伊红(HE)染色后，镜下观察并参照文献〔8〕中的评分标准进行结肠损伤评分。

1.2.4.2ELISA法检测血清IL-2、IL-4及IL-10含量 应用相应试剂盒检测大鼠血清IL-2、IL-4及IL-10含量，使用酶标仪测出OD值，并且做出标准曲线，计算各组大鼠相应细胞因子的表达水平。

1.2.4.3RT-qPCR法检测IL-2、IL-4及IL-10 mRNA的表达 ① 提取总RNA，逆转录合成cDNA。②引物序列：GAPDH-正义

5′GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3′,GAPDH-反义5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′，143 bp;IL-2-正义5′GCAGCGTGTGTTGGATTTGAC3′,IL-2-反义5′TGCTGGCTCATCATCGAATTG3′,142 bp;IL-4-正义5′TGCACCGAGATGTTTGTACCAGA3′,IL-4-反义5′TTGCGAAGCACCCTGGAAG3′,92 bp;IL-10-正义5′CAGACCCACATGCTCCGAGA3′,IL-10-反义5′CAAGGCTTGGCAA CCCAAGTA3′,141 bp。③ PCR扩增反应：反应体系为25 μl，反应条件：预变性90℃ 30 s、PCR反应95℃ 5 s，60℃ 30 s循环40次、溶解。④ 取各组Ct值，△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值，2-△△Ct法计算相对定量，每个样本均重复3孔后取均值。

1.3统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠一般生存状况 空白组大鼠反应敏捷，饮食、活动情况正常，精神佳，毛发柔顺有光泽，粪便呈棕褐色颗粒。模型组大鼠造模第14天开始出现蜷卧，扎堆倦怠，毛色晦暗，食量减少，体重减轻，大便质软等脾肾阳虚的症状；造模后均出现稀便、黏液便、部分可见脓血便，肛周污秽，精神萎靡，倦怠，畏寒，体型消瘦，成群蜷缩或弓背，毛发枯槁疏散无光泽等症状。经药物治疗后，治疗组大鼠毛发洁净，反应较灵活，精神、饮食尚可，大便基本成形，个别出现软便，其中，久泻灵颗粒高剂量组大鼠毛发洁净有光泽，反应灵敏，大便呈颗粒状。

2.2各组大鼠镜下病理改变 空白组结肠组织完整，大量单直管状肠腺充满于黏膜层，开口于黏膜表面，大量的杯状细胞、弥散淋巴细胞和孤立淋巴小结分布于固有层结缔组织。与空白组相比，模型组结肠黏膜明显充血水肿，大量炎性细胞浸润于黏膜层、黏膜下层，肌层见大量成纤维细胞和胶原纤维形成肉芽组织，隐窝脓肿明显。久泻灵颗粒各剂量组和SASP组隐窝结构基本完整，淋巴细胞、中性粒细胞少量浸润，其中高剂量组仅部分黏膜及下层有少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 大鼠结肠组织HE染色病理图(×100)

2.3各组大鼠结肠黏膜大体形态学评分 与空白组相比，模型组评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，其余各治疗组评分均降低(P<0.01)，高剂量组最显著。见表1。

2.4各组大鼠结肠中IL-2、IL-4及IL-10 mRNA表达比较 与空白组相比，模型组大鼠结肠组织中IL-2、IL-4、IL-10 mRNA表达及血清IL-2、IL-4、IL-10含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，各治疗组大鼠结肠组织IL-2、IL-4、IL-10 mRNA表达量及血清IL-2、IL-4、IL-10含量升高，高剂量组效果更显著(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表1 各组大鼠结肠黏膜组织损伤评分

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，与高剂量组比较：3)P<0.01，4)P<0.05；下表同

表2 各组大鼠结肠组织IL-2、IL-4及IL-10 mRNA含量与血清IL-2、IL-4、IL-10水平比较

3 讨 论

相关研究证实，免疫因素在UC发病过程中起到重要作用。 IL-2由辅助性T(Th)细胞产生，可以诱导淋巴细胞分化增殖，提高T细胞和自然杀伤(NK)细胞活性，还能促进B细胞分化增殖，具有免疫激活和免疫耐受的双向调节作用〔9,10〕。IL-4由Th2细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，可以诱导B细胞、Th细胞及肥大细胞的分化，阻断Th1细胞产生细胞因子和巨噬细胞以减少促炎因子的产生，抑制炎症反应〔11〕。IL-10由Th2细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞产生，阻断Th1细胞激活和巨噬细胞的功能〔12〕。IL-2、IL-4及IL-10作为抑炎性细胞因子，具有免疫调节活性，在UC发病过程中起到重要的免疫调节作用，保护肠黏膜屏障。本研究结果提示脾肾阳虚型UC模型与抑炎因子IL-2、IL-4、IL-10的表达密切相关；久泻灵颗粒可促进抑炎因子的表达起到抗炎作用，可以抑制炎症反应对结肠黏膜的损伤起到保护作用，提示中西药治疗可有效改善病情，高剂量组疗效优于西药治疗。

久泻灵颗粒具有渗湿止泻、温补脾肾、燮理阴阳的功效。辛苦大温之补骨脂为君，重用以补命门之火则脾土得温，针对肾虚泄泻；理中丸作臣药，其功效温中祛寒，补气健脾是为温补并用，先天之本与后天之本互资互生；佐以肉豆蔻温暖脾胃配合君药温肾暖脾，再佐酸味之五味子，固肾涩肠；辛苦大热之吴茱萸，温肝脾肾以散寒，可辅君臣。诸药并用，火旺土强，脾肾阳虚泄泻得愈。

综上所述，久泻灵颗粒能促进脾肾阳虚型UC模型大鼠中IL-2、IL-4及IL-10的表达，从而抑制炎症反应的发展，对结肠黏膜有保护作用。

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3朱佳杰,苏晓兰,刘 珊，等.病证结合复制大鼠脾肾阳虚腹泻型肠易激综合征模型的探讨〔J〕.上海中医药杂志,2016;50(9):15-7，35.

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8Geboes K,Riddell R,Ost A,etal.A reproducible grading scale for histological assessment of inflammation in ulcerative colitis〔J〕.Gut,2000;47(3):404-9.

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EffectofJIUXIELINGgranulesonthelevelsofIL-2,IL-4andIL-10inulcerativecolitisratswithspleenandkidneyyangdeficiency

YINYin-Xia,LIUYong-Hua,LIUXiang-Yu,etal.

ShenzhenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Shenzhen518116,Guangdong,China

ObjectiveTo detect the changes of IL-2,IL-4 and IL-10 of serum of spleen and kidney yang deficiency model of ulcerative colitis in rats treated by Jiuxieling granules.Methods90 rats were randomly divided into blank control, UC model of spleen kidney yang deficiency, and Jiuxieling granules treatment groups for high dose, medium dose and low dose, respectively, and positive control group (SASP). The levels of IL-2, IL-4 and IL-10 in serum were detected by ELISA after drug intervention.ResultsCompared with those of blank group，the injury score of colon tissue of model group was increased(P<0.01),compared with that of model group, the injury score of colon tissue of treatment group was reduced(P<0.01). Compared with those of blank group, the levels of IL-2, IL-4 and IL-10 in serum of model group were reduced(P<0.05); compared with those of model group, the levels of IL-2, IL-4 and IL-10 in serum of treatment group were increased(P<0.05); and dramatically in the Jiuxieling granules treatment groups for high dose.ConclusionsJiuxieling granules regulate the immune activities to improve the levels of IL-2, IL-4 and IL-10 in serum of spleen and kidney yang deficiency model UC rats and inhibit inflammation and protect colonic mucosa.

Jiuxieling granules;Ulcerative colitis;IL-2; IL-4; IL-10

R28

A

1005-9202(2017)23-5766-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.009

国家自然科学基金项目(No.81260520)

1 甘肃中医药大学

吴玉泓(1967-)，男，博士，硕士生导师,主要从事脾胃病病证结合及动物模型研究。

殷银霞(1968-)，女，主任医师，主要从事中医老年病及治则治法研究。

〔2017-05-12修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)