Smad3对高糖环境下足细胞凋亡的影响

哈丽达·木沙 玛依拉·卡哈尔 玉山江·艾克木

(新疆医科大学第一附属医院VIP内科，新疆 乌鲁木齐 830054)

Smad3对高糖环境下足细胞凋亡的影响

哈丽达·木沙 玛依拉·卡哈尔 玉山江·艾克木1

(新疆医科大学第一附属医院VIP内科，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的探讨果蝇Mad基因3哺乳动物类似基因(Smad3)对高糖环境下足细胞凋亡的影响。方法足细胞分为对照组、高糖组、干扰组，对照组、高糖组在实验开始前转染siRNA control，干扰组转染Smad3 siRNA。高糖组、干扰组用含有25 mmol/L的D葡萄糖细胞培养液培养，对照组用含有5 mmol/L的D葡萄糖细胞培养液培养。Western印迹检测Smad3、磷酸化的Smad3(p-Smad3)、酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl/白血病-x基因长片段(Bcl-xl)水平，流式细胞术检测细胞凋亡。结果高糖组细胞中Smad3水平与对照组相比无明显差异(P>0.05),而p-Smad3水平明显高于对照组(P<0.05)。干扰组细胞中Smad3、p-Smad3水平均明显低于高糖组(P<0.05)。高糖组细胞凋亡率明显高于对照组，干扰组明显低于高糖组(均P<0.05)。高糖组Cleaved Caspase-3、Bax水平明显高于对照组，Bcl-xl水平明显低于对照组(均P<0.05)，干扰组Cleaved Caspase-3、Bax水平均明显低于高糖组，Bcl-xl水平明显高于高糖组(均P<0.05)。结论高糖环境下，足细胞中Smad3磷酸化水平升高，细胞凋亡增多，而下调Smad3可以抑制高糖诱导的足细胞凋亡，抑制Cleaved Caspase-3、Bax表达，促进Bcl-xl表达。

足细胞；Smad3；高糖；细胞凋亡

糖尿病肾病是一种糖尿病并发症，以蛋白尿、肾功能减退为主要临床特征，以系膜变宽、系膜细胞外基质聚集、系膜细胞弥漫性和结节状增殖为主要病理变化〔1〕。研究显示，肾小球滤过功能损伤是糖尿病肾病发生和发展的重要原因，足细胞作为肾小球滤过功能的关键组成部分在肾组织损伤中发挥重要作用〔2〕。足细胞附着在肾小球基底膜的外侧，是一种终末分化细胞，具有极高的特异性，是肾小球滤过屏障中的重要组成部分〔3〕。果蝇Mad基因3哺乳动物类似基因(Smad3)是Smads蛋白家族中的成员之一，也是一种特异性的效应分子，能够将细胞外的信号传递至细胞内〔4〕。研究显示，Smad3能够调控细胞的生长，并且参与高糖诱导的足细胞凋亡过程〔5〕。本研究在体外用高糖培养液培养足细胞，通过细胞转染的方法探讨Smad3在足细胞凋亡中的作用。

随着我国社会和经济的不断发展，人们回归自然、回归传统的欲望也更加明显，在这样的背景之下，现代酒类包装设计人员必须在实际工作开展过程中避免对传统文化元素的简单模仿和复制，而应将这些元素与新型材料、新型生产技术等有效的结合起来，进而确保酒类产品包装的进一步升华。本研究主要结合以下实例对陶瓷造型元素在现代酒器设计中的应用进行分析。

1 材料与方法

1.1一般材料 永生化足细胞为某实验室保存。Smad3一抗、磷酸化的Smad3(p-Smad3)一抗为美国Abcam公司产品；酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)一抗、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)一抗、Bcl/白血病-x基因长片段(Bcl-xl)一抗为美国CST公司产品；GAPDH一抗为美国GeneTex公司产品；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、重组γ-干扰素(γ-IFN)均为美国Sigma公司产品；链霉素、青霉素、(DMEM)F12均为美国Gibco公司产品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒为美国Thermo公司产品；细胞蛋白提取试剂盒为德国qiagen公司产品

1.2细胞培养 足细胞在33℃，5% CO2培养箱中培养，培养方法参照参考文献〔6〕，在培养瓶或培养板的底部用0.1 mg/ml的Ⅰ型胶原酶预先处理1 h。取没有分化的足细胞，悬浮在细胞培养液(含有10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素、10 U/ml γ-IFN、100 U/ml青霉素的DMEM F12)中培养，传代用含有0.25% 胰蛋白酶的消化液传代。在实验开始前将足细胞更换为不含有γ-IFN的细胞培养液诱导分化14 d后，用于后续实验。

1.3细胞分组 足细胞分为对照组、高糖组、干扰组，其中对照组、高糖组在实验开始前转染siRNA control，干扰组细胞转染Smad3 siRNA。实验0 h时，高糖组、干扰组用含有25 mmol/L的D葡萄糖细胞培养液培养，对照组用含有5 mmol/L的D葡萄糖细胞培养液培养。

2.1高糖及细胞转染对足细胞中Smad3水平的影响 高糖组细胞中Smad3水平(0.64±0.03)与对照组(0.65±0.06)相比无统计学差异(P>0.05)，而p-Smad3水平(0.68±0.05)明显高于对照组(0.44±0.04，P<0.05)。干扰组细胞中Smad3、p-Smad3水平(0.31±0.02，0.29±0.03)均明显低于高糖组(P<0.05)。见图1。

沙三下亚段位于接近盆地基底的低部位。由于基底断裂发育和断裂的持续活动，将不断地释放构造应力，从而对与其紧邻的、脆性较大的上覆碳酸盐岩砾岩层进行改造，以致产生构造裂缝甚至小断层（图2）。高产井车66、车660井即位于盆地基底断裂带上。该断裂带近东西向延伸，断层断距小延伸较短，以至于在地震剖面上难以识别，但对储层物性的影响却是显著的。因此，沿断裂带延伸方向应是油气相对富集的地带。

2.3Smad3对高糖环境下细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平的影响 高糖组Cleaved Caspase-3、Bax水平明显高于对照组(P<0.05)，Bcl-xl水平明显低于对照组(P<0.05)。干扰组Cleaved Caspase-3、Bax水平均明显低于高糖组(P<0.05)，Bcl-xl水平明显高于高糖组(P<0.05)。见图2，表1。

糖尿病患者体内长期处于高糖状态，而高糖状态会导致足细胞损伤，导致蛋白漏出形成蛋白尿，而足细胞在蛋白尿的作用下损伤加重，可见足细胞在糖尿病肾病发生过程中发挥重要作用〔7〕。足细胞凋亡增多，数量急剧减少，造成足细胞的流动性增强，进而形成肾小球硬化和局灶粘连〔8〕。本研究结果显示，高糖培养后的足细胞凋亡数目增多，证实了高糖能够促进足细胞凋亡。

2 结 果

1.4细胞转染 取足细胞，培养至对数期后，加入胰蛋白酶消化细胞，800 r/min离心10 min，将上清液吸除后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞沉淀2次，把细胞浓度调整为3×105个/ml，按照每孔加入2 ml细胞悬浮液种植到6孔板中，观察细胞密度为60%进行转染。用不含血清的培养液将Smad3 siRNA、siRNA control稀释后，孵育20 min，记为A混合液。用不含血清的细胞培养液与转染试剂Lip2000混合后，记为B混合液。把A液和B液混合后，加入细胞中孵育6 h，按照对照组、高糖组、干扰组分组更换细胞培养液，培养48 h，用于后续检测。

2.2Smad3对高糖诱导细胞凋亡的影响 高糖组细胞凋亡率(28.15%±3.14%)明显高于对照组(8.95%±0.82%，P<0.05)，干扰组(14.28%±1.73%)明显低于高糖组(P<0.05)。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 取1.4中对照组、高糖组、干扰组细胞，胰蛋白酶消化后，加入4℃预冷的PBS，收集1×106个细胞，用400 μl缓冲液悬浮后，分别加入5 μl 碘化丙啶(PI)和5 μl 膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)，放在避光环境中，室温反应20 min，再加入200 μl缓冲液，流式细胞仪测定细胞凋亡。

1.5Western印迹检测细胞中Smad3、p-Smad3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平 取1.4中对照组、高糖组、干扰组细胞，加入细胞裂解液，在冰上裂解20 min，转移至离心管中，12 000 r/min，4℃离心10 min。用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品与5倍上样缓冲液以4∶1的比例混合，100℃煮沸3 min使蛋白变性。每孔加入40 μg的蛋白样品进行蛋白电泳(5%浓缩胶，10%分离胶)。80 V电压电泳30 min后，观察溴酚蓝达到分离胶时，把电压调整到120 V继续电泳。电泳结束后，在100 V电压，4℃转膜90 min，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。取出硝酸纤维素膜，放在5%脱脂奶粉中，37℃孵育60 min。与一抗(Smad3稀释1 000倍、p-Smad3稀释800倍、Cleaved Caspase-3稀释1 000倍、Bax稀释1 000倍、Bcl-xl稀释1 000倍)4℃孵育过夜后，加入3 000倍稀释的二抗室温孵育60 min，显色，以GAPDH为内参，用Bandscan 5.0分析蛋白水平。

图1 Western印迹检测各组细胞中Smad3水平

图2 Western印迹检测Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平

表1 各组细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与高糖组比较：2)P<0.05

3 讨 论

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

Smads是近年来发现的蛋白，在肺泡上皮细胞、肿瘤细胞、足细胞等多种细胞中广泛表达，且与胚胎发育、组织生成、骨骼重建等有关〔9〕。Smads还参与肺组织纤维化、心肌梗死、癌症发生、肺阻塞等疾病发生，后续的研究报道，Smads与糖尿病肾病的发生有关，在肾小管上皮细胞、足细胞中均有不同程度的表达，糖尿病肾病患者中Smad3水平升高，且能够促进肾组织的纤维化〔10〕。李桂英〔11〕在研究骨形态蛋白在高糖环境下足细胞中的作用时发现，Smad3参与足细胞凋亡过程。正常情况下，Smad3以非活化的形式存在，当受到外界信号刺激后，Smad3磷酸化后生成p-Smad3发挥其生物学功能〔12〕。本研究结果显示，高糖刺激后的Smad3磷酸化水平升高，说明Smad3参与糖尿病肾病的发生，Smad3下调可以抑制高糖诱导的足细胞凋亡。

综上，以铂类为基础的3种化疗方案均能有效控制乳腺癌，具有较好的临床疗效，均可以作为临床上治疗晚期TNBC的方案选择。

对平板划线的单菌落进行形态观察。革兰氏染色包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤，具体操作步骤见文献[7]。

细胞凋亡的发生与细胞内基因的转录有关，是细胞维持内环境稳定的过程，也是一个细胞主动调控的过程〔13〕。目前对于细胞凋亡的作用机制尚不十分明确，Bcl-2蛋白家族参与细胞凋亡过程，含有多个成员，这些成员在细胞凋亡过程中发挥的作用不同，Bax能够促进细胞凋亡的发生，属于促凋亡蛋白；而Bcl-xl抑制细胞凋亡的发生，属于抗凋亡蛋白〔14〕。Caspase蛋白家族参与细胞凋亡，其激活后引发的级联反应能够促进细胞凋亡的发生，Caspase-3是一种凋亡执行因子，正常状态下以非活化的酶原形式存在，蛋白受到上游信号因子作用后，可以形成Cleaved Caspase-3促进细胞凋亡，Caspase-3的活化标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段〔15〕。研究表明，Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族均参与足细胞的凋亡过程〔16〕。本研究结果显示，下调Smad3可以部分拮抗高糖的作用，下调Smad3可以通过作用于Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl抑制高糖诱导的足细胞凋亡。

1李惠秀,曹文富.糖尿病肾病发病机制及治疗进展〔J〕.重庆医学,2013；42(21)：2545-7.

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3Du P,Fan B,Han H,etal.NOD2 promotes renal injury by exacerbating inflammation and podocyte insulin resistance in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,2013；84(2)：265-76.

4Yang H,Wang L,Zhao J,etal.TGF-β-activated SMAD3/4 complex transcriptionally upregulates N-cadherin expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer,2015；87(3)：249-57.

5Sun YBY,Qu X,Howard V,etal.Smad3 deficiency protects mice from obesity-induced podocyte injury that precedes insulin resistance〔J〕.Kidney Int,2015；88(2)：286-98.

6Yu L,Lin Q,Feng J,etal.Inhibition of nephrin activation by c-mip through Csk-Cbp-Fyn axis plays a critical role in angiotensin Ⅱ-induced podocyte damage〔J〕.Cell Signal,2013；25(3)：581-8.

7You H,Gao T,Raup-Konsavage WM,etal.Podocyte-specific chemokine (CC motif) receptor 2 overexpression mediates diabetic renal injury in mice〔J〕.Kidney Int,2017;91(3)：671-82.

8Chen J,Chen JK,Harris RC.EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol,2015;26(5)：1115-25.

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10贾会玉,李 莉,吕 磊,等.基于 TGF-β1/Smads 信号通路探讨丹蛭降糖胶囊对大鼠糖尿病肾病的防治作用〔J〕.中国药理学通报,2015；31(11)：99.

11李桂英.Gremlin1 在高糖环境足细胞损伤中的作用及机制研究〔D〕.石家庄：河北医科大学,2013.

12Yan YM,Ai J,Zhou LL,etal.Lingzhiols,unprecedented rotary door-shaped meroterpenoids as potent and selective inhibitors of p-Smad3 from Ganoderma lucidum〔J〕.Org Lett,2013;15(21)：5488-91.

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R587.2

A

1005-9202(2017)23-5763-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.008

新疆维吾尔自治区科技攻关和重点科技项目(201233398)

1 新疆医科大学附属中医医院干一科

玉山江·艾克木(1968-)，男，硕士，主任医师，主要从事糖尿病及其并发症研究。

哈丽达·木沙(1975-)，女，硕士，副主任医师，主要从事糖尿病及其并发症研究。

〔2017-06-15修回〕

(编辑 滕欣航)