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动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关机制

2017-12-22郭靖涛张金艳

中国老年学杂志 2017年23期
关键词:类似物平滑肌荧光素酶

王 昆 郭靖涛 张金艳 周 江

(承德市中心医院心血管内科,河北 承德 067000)

心、脑血管及代谢性疾病·

动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关机制

王 昆 郭靖涛 张金艳 周 江

(承德市中心医院心血管内科,河北 承德 067000)

目的探讨动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关作用机制。方法选取该院收治的动脉粥样硬化患者42例,收集同期42名健康老年人为对照。qRT-PCR检测外周血清miR-520b表达水平。经targetscan和miRanda数据库预测importin 8(IPO8)为miR-520b的可能靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测证实;体外细胞实验采用Western印迹检测miR-520b对人血管内皮细胞IPO8表达的影响;CCK-8法和Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响。结果动脉粥样硬化患者血清miR-520b相对表达量低于健康老年人(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测证实IPO8是miR-520b的直接作用靶基因;转染miR-520b类似物人血管内皮细胞IPO8蛋白相对表达量低于类似物阴性对照组(P<0.05);转染特异性miR-520b抑制物后,血管内皮细胞中IPO8蛋白相对表达量高于抑制物对照组(P<0.05)。提升miR-520b表达后人血管平滑肌细胞增殖和迁徙能力均低于相应阴性对照(P<0.05);抑制miR-520b表达后人血管平滑肌细胞增殖和迁徙能力均高于相应阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平明显降低;miR-520b可通过阻断NF-κB信号通路及抑制血管平滑肌细胞增殖、迁徙来发挥抗动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化;miR-520b;NF-κB通路;细胞增殖、细胞迁移

动脉粥样硬化是一个复杂的慢性病变过程,涉及血液成分、动脉壁细胞、胞外基质、遗传和环境等多种因素的相互作用〔1〕。血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、巨噬细胞炎性介质释放是动脉粥样硬化的3个重要过程,其中NF-κB途径是介导血管内皮细胞损伤,炎性介质释放的重要信号通路,而importin(IPO)家族是NF-κB核内移的关键转运蛋白〔2〕。miRNA参与一系列内源性分子调控过程,相关研究显示,miRNA在动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥重要调控作用〔3〕,miR-520b参与调控大鼠血管内皮细胞激活和炎症反应〔4〕,推测其与动脉粥样硬化形成相关,但基于临床患者的研究仍鲜有报道。本次研究选取42例动脉粥样硬化患者,检测血清miR-520b的表达情况,并探讨miR-520b对人血管内皮细胞中靶基因IPO8表达及人血管平滑肌细胞增殖、迁徙能力的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年6月至2016年10月间承德市中心医院收治的动脉粥样硬化患者42例。患者血脂明显升高,外周血管彩色多普勒超声诊断为Ⅱ~Ⅲ级动脉粥样硬化,签署知情同意书。其中男31例,女11例,年龄62~88岁,平均(77.25±9.61)岁。收集同期42例健康老年人,其中男性29例,女性13例,年龄60~89岁,平均(76.19±11.24)岁。两组受试者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理 采集两组受试者外周血10 ml,4 000 r/min离心20 min,收集上层血清,4℃保存。人血管平滑肌细胞和内皮细胞购于上海中乔新舟生物科技有限公司,放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规传代培养。

1.2.2qRT-PCR检测血清中miR-520b表达水平 取血清2 ml,Trizol法提取总RNA,逆转录合成cDNA。miR-520b茎环结构逆转录引物和RCR扩增上下游引物均由生工生物(上海)有限公司合成。反应体系20 μl,反应条件:92℃ 10 min;95℃ 30 s,共40个循环;55℃ 1 min;4℃维持。Run6b为内参,计算miR-520b相对表达量。

1.2.3细胞转染 取对数期人血管平滑肌细胞按1×106/孔的密度接种于6孔板中,常规培养24 h,细胞密度>50%后进行传染。miR-520b类似物、抑制剂和对应的阴性对照均由生工生物(上海)有限公司合成。进行细胞瞬时转染,6孔板中每孔细胞转染13 μl miR-520b抑制剂或8 μl miR-520b类似物,培养48 h后收集细胞行Western印迹检测。按1×104/孔密度将细胞接种于96孔板中,试剂用量为6孔板的10%,转染方法同上,用于细胞增殖实验。FAM荧光对照和定量PCR检测转染效率;人内皮细胞转染方法同人血管平滑肌细胞。

1.2.4miR-520b靶基因预测和双荧光素酶检测 使用targetscan和miRanda数据库预测miR-520b可能靶基因,选取IPO8作为本次研究的靶基因。双荧光素酶报告基因检测使用的萤火虫荧光素酶载体(pgl4.10质粒)和海肾荧光素酶载体(pRL-Null质粒)由上海远慕生物科技有限公司提供。目的基因IPO8的DNA片段由生工生物(上海)有限公司合成。构建重组质粒,经转化、扩增后行双荧光素酶报告基因检测,以CHO细胞作为工具细胞转染,分为4组:①空白对照组:转染pgl4.10空载体+pRL-Null空载体;②阴性对照组:转染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重组质粒+类似物阴性对照+pRL-Null载体;③实验组:转染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重组质粒+miR-520b类似物+ pRL-Null载体;④突变体组:转染pgl4.10-miR-IPO8-mutant-3′UTR重组质粒+ miR-520b类似物+ pRL-Null载体。检测荧光素酶活性,计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比值。

1.2.5Western印迹检测IPO8表达水平 人内皮细胞按1×106/孔的密度接种于6孔板中,转染miR-520b类似物、抗miR-520b抑制物和阴性对照,培养72 h后收集细胞,提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,行SDS-PAGE电泳、转膜,加一抗(IPO8多克隆抗体,1∶1 000)、二抗,电化学发光(ECL)显色后扫描拍照,计算灰度值。

1.2.6细胞计数和迁徙实验 采用CCK-8法检测人血管平滑肌细胞增殖能力,试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司,操作按说明书进行,酶标仪读取450nm波长出吸光度值。Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞迁移能力的影响。将小室放入24孔板中,细胞按1×106/孔的密度接种到上室、下室,分别加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培养液,孵育24 h后小室膜上细胞用乙醇固定,0.1%结晶紫染色,显微镜下观察侵袭细胞。

1.3统计学分析 使用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1患者血清中miR-520b表达水平 动脉粥样硬化患者血清miR-520b相对表达量为32.75±1.18,低于健康老年人的83.39±6.82,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2验证IPO8是miR-520b的靶基因 实验组通过共转染克隆IPO8 mRNA-3′UTR片段的萤火虫荧光素酶载体、海肾荧光素酶载体和miR-520b类似物的荧光素蛋白相对表达量分别为17.13±0.58、25.06±0.74、29.31±4.43,低于空白对照组和阴性对照组的59.37±2.61、54.01±5.54,差异有统计学意义(P<0.01)。突变体组荧光素蛋白相对表达量为28.68±3.35,高于实验组的17.13±0.48,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3转染miR-520b类似物、抑制物对人血管内皮细胞IPO8表达的影响 转染miR-520b类似物人血管内皮细胞IPO8蛋白相对表达量为0.39±0.07,低于类似物阴性对照组的0.92±0.16,差异有统计学意义(P<0.05);转染特异性miR-520b抑制物后,血管内皮细胞中IPO8蛋白相对表达量为0.71±0.13,高于抑制物对照组的0.35±0.16,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.4miR-520b对人血管平滑肌细胞增殖的影响 小RNA转染人血管平滑肌细胞,提升miR-520b表达后CCK8法检测细胞增殖吸光度均值为1.68±0.29,低于相应阴性对照的2.77±0.25,差异有统计学意义(P<0.05);抑制miR-520b表达后吸光度值为2.97±0.15,高于相应阴性对照的1.91±0.09,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5miR-520b对人血管平滑肌细胞迁徙的影响 提升miR-520b表达后人血管平滑肌细胞迁徙能力为8.65±0.93,低于相应阴性对照的19.75±1.28,差异有统计学意义(P<0.01);抑制miR-520b表达后人血管平滑肌细胞迁徙能力为14.31±1.47,高于相应阴性对照的8.63±1.40,差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

1为miR-520b抑制物组;2为抑制物阴性对照组;3为类似物阴性对照组;4为miR-520b类似物组;5为空白对照组图1 miR-520b对人血管内皮细胞中IPO8蛋白表达的影响

图2 Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞迁徙能力的影响(×200)

3 讨 论

动脉粥样硬化是常见的心血管系统病变,也是多种心脑血管病的病理基础。有研究显示,miRNA在动脉粥样硬化进展中发挥重要调控作用,如人动脉内皮细胞中,miR-155表达上调可降低氮氧化物合酶的分泌量和活性,引发细胞功能障碍〔5〕;而miR-125表达上调和miR-126表达下调会增加内皮细胞炎性蛋白分泌量〔6〕。近期研究显示,miR-520家族广泛参与炎症、再生障碍性贫血、肿瘤等病理生理过程〔7〕,但尚缺少在动脉粥样硬化过程中的作用研究。

本次研究显示,动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平明显低于健康老年人;进一步靶基因筛查得到IPO8是miR-520b可能的作用靶基因,IPO家族是NF-κB核内移的关键转运蛋白,而核内移是NF-κB信号通路激活的必需步骤,该信号途径已被证实为血管内皮细胞相关炎症反应的一个重要途径。以此为基础本次研究将IPO8作为进一步研究的靶基因,并通过双荧光素酶检测证实其是miR-520b可通过调控IPO8的表达水平来抑制NF-κB信号通路激活,进而降低血管内皮细胞炎症反应。内皮细胞炎症激活会促进炎性因子、纤维生长因子等释放,进而刺激血管平滑肌细胞向合成型转换,引发血管中层平滑肌细胞向受损内膜的增殖、迁徙,引发血管内膜厚度增加、纤维化、斑块形成、闭塞。本次研究显示进一步证实了miR-520b过表达会抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁徙,对抗动脉粥样硬化。相关研究显示,阻断血管平滑肌细胞中IPO介导的NF-κB核内移,可抑制炎症反应〔8〕,但目前未见关于miR-520b能否影响人血管平滑肌细胞中IPO表达的报道,需深入研究。

1吴玉芬,覃玉巧,卢昌均,等.老年动脉粥样硬化性脑梗死患者血清visfatin水平变化〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(21):6096-8.

2颜 晖.MicroRNAs在动脉粥样硬化中的初探〔D〕.武汉:华中科技大学,2012.

3邱明涛.动脉粥样硬化microRNA表达谱的研究〔D〕.福州:福建医科大学,2014.

4何少林.Treg/microRNA-181b对血管内皮细胞损伤的保护作用及机制〔D〕.武汉:华中科技大学,2013.

5李春颖,李继成,申祥凤,等.茶多酚对大鼠动脉粥样硬化防治作用研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2014;15(4):468-71.

6康桂兰,景增秀.老年急性动脉粥样硬化性脑血栓患者外周血同型半胱氨酸的变化及意义〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(13):3182-3.

7孟 盈,徐 荣,王迎春,等.颈动脉粥样硬化斑块超声造影方法学比较的初步探讨〔J〕.中国卫生工程学,2016;15(6):608-11.

8李永辉.miR-29a在动脉粥样硬化发生发展中的作用及其分子机制〔D〕.石家庄:河北医科大学,2013.

R541.4

A

1005-9202(2017)23-5801-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.022

河北省科学技术厅项目(20143217)

郭靖涛(1964-),男,博士,主任医师,主要从事冠心病及心律失常介入诊疗及高血压、心力衰竭的防治等研究。

王 昆(1979-),女,硕士,主治医师,主要从事冠心病诊疗及高血压、心力衰竭、心律失常的防治等研究。

〔2017-09-10修回〕

(编辑 袁左鸣)

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