动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关机制

2017-12-22郭靖涛张金艳

中国老年学杂志 2017年23期

关键词：类似物平滑肌荧光素酶

王昆郭靖涛张金艳周江

(承德市中心医院心血管内科，河北承德 067000)

心、脑血管及代谢性疾病·

动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关机制

王昆郭靖涛张金艳周江

(承德市中心医院心血管内科，河北承德 067000)

目的探讨动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平及相关作用机制。方法选取该院收治的动脉粥样硬化患者42例，收集同期42名健康老年人为对照。qRT-PCR检测外周血清miR-520b表达水平。经targetscan和miRanda数据库预测importin 8(IPO8)为miR-520b的可能靶基因，通过双荧光素酶报告基因检测证实；体外细胞实验采用Western印迹检测miR-520b对人血管内皮细胞IPO8表达的影响；CCK-8法和Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响。结果动脉粥样硬化患者血清miR-520b相对表达量低于健康老年人(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测证实IPO8是miR-520b的直接作用靶基因；转染miR-520b类似物人血管内皮细胞IPO8蛋白相对表达量低于类似物阴性对照组(P<0.05)；转染特异性miR-520b抑制物后，血管内皮细胞中IPO8蛋白相对表达量高于抑制物对照组(P<0.05)。提升miR-520b表达后人血管平滑肌细胞增殖和迁徙能力均低于相应阴性对照(P<0.05)；抑制miR-520b表达后人血管平滑肌细胞增殖和迁徙能力均高于相应阴性对照，差异有统计学意义(P<0.05)。结论动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平明显降低；miR-520b可通过阻断NF-κB信号通路及抑制血管平滑肌细胞增殖、迁徙来发挥抗动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化；miR-520b；NF-κB通路；细胞增殖、细胞迁移

动脉粥样硬化是一个复杂的慢性病变过程，涉及血液成分、动脉壁细胞、胞外基质、遗传和环境等多种因素的相互作用〔1〕。血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、巨噬细胞炎性介质释放是动脉粥样硬化的3个重要过程，其中NF-κB途径是介导血管内皮细胞损伤，炎性介质释放的重要信号通路，而importin(IPO)家族是NF-κB核内移的关键转运蛋白〔2〕。miRNA参与一系列内源性分子调控过程，相关研究显示，miRNA在动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥重要调控作用〔3〕，miR-520b参与调控大鼠血管内皮细胞激活和炎症反应〔4〕，推测其与动脉粥样硬化形成相关，但基于临床患者的研究仍鲜有报道。本次研究选取42例动脉粥样硬化患者，检测血清miR-520b的表达情况，并探讨miR-520b对人血管内皮细胞中靶基因IPO8表达及人血管平滑肌细胞增殖、迁徙能力的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年6月至2016年10月间承德市中心医院收治的动脉粥样硬化患者42例。患者血脂明显升高，外周血管彩色多普勒超声诊断为Ⅱ～Ⅲ级动脉粥样硬化，签署知情同意书。其中男31例，女11例，年龄62～88岁，平均(77.25±9.61)岁。收集同期42例健康老年人，其中男性29例，女性13例，年龄60～89岁，平均(76.19±11.24)岁。两组受试者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理采集两组受试者外周血10 ml，4 000 r/min离心20 min，收集上层血清，4℃保存。人血管平滑肌细胞和内皮细胞购于上海中乔新舟生物科技有限公司，放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规传代培养。

1.2.2qRT-PCR检测血清中miR-520b表达水平取血清2 ml，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。miR-520b茎环结构逆转录引物和RCR扩增上下游引物均由生工生物(上海)有限公司合成。反应体系20 μl，反应条件：92℃ 10 min；95℃ 30 s，共40个循环；55℃ 1 min；4℃维持。Run6b为内参，计算miR-520b相对表达量。

1.2.3细胞转染取对数期人血管平滑肌细胞按1×106/孔的密度接种于6孔板中，常规培养24 h，细胞密度>50%后进行传染。miR-520b类似物、抑制剂和对应的阴性对照均由生工生物(上海)有限公司合成。进行细胞瞬时转染，6孔板中每孔细胞转染13 μl miR-520b抑制剂或8 μl miR-520b类似物，培养48 h后收集细胞行Western印迹检测。按1×104/孔密度将细胞接种于96孔板中，试剂用量为6孔板的10%，转染方法同上，用于细胞增殖实验。FAM荧光对照和定量PCR检测转染效率；人内皮细胞转染方法同人血管平滑肌细胞。

1.2.4miR-520b靶基因预测和双荧光素酶检测使用targetscan和miRanda数据库预测miR-520b可能靶基因，选取IPO8作为本次研究的靶基因。双荧光素酶报告基因检测使用的萤火虫荧光素酶载体(pgl4.10质粒)和海肾荧光素酶载体(pRL-Null质粒)由上海远慕生物科技有限公司提供。目的基因IPO8的DNA片段由生工生物(上海)有限公司合成。构建重组质粒，经转化、扩增后行双荧光素酶报告基因检测，以CHO细胞作为工具细胞转染，分为4组：①空白对照组：转染pgl4.10空载体+pRL-Null空载体；②阴性对照组：转染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重组质粒+类似物阴性对照+pRL-Null载体；③实验组：转染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重组质粒+miR-520b类似物+ pRL-Null载体；④突变体组：转染pgl4.10-miR-IPO8-mutant-3′UTR重组质粒+ miR-520b类似物+ pRL-Null载体。检测荧光素酶活性，计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比值。

1.2.5Western印迹检测IPO8表达水平人内皮细胞按1×106/孔的密度接种于6孔板中，转染miR-520b类似物、抗miR-520b抑制物和阴性对照，培养72 h后收集细胞，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳、转膜，加一抗(IPO8多克隆抗体，1∶1 000)、二抗，电化学发光(ECL)显色后扫描拍照，计算灰度值。

1.2.6细胞计数和迁徙实验采用CCK-8法检测人血管平滑肌细胞增殖能力，试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司，操作按说明书进行，酶标仪读取450nm波长出吸光度值。Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞迁移能力的影响。将小室放入24孔板中，细胞按1×106/孔的密度接种到上室、下室，分别加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，孵育24 h后小室膜上细胞用乙醇固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下观察侵袭细胞。

1.3统计学分析使用SPSS18.0软件行t检验。

2 结果

2.1患者血清中miR-520b表达水平动脉粥样硬化患者血清miR-520b相对表达量为32.75±1.18，低于健康老年人的83.39±6.82，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2验证IPO8是miR-520b的靶基因实验组通过共转染克隆IPO8 mRNA-3′UTR片段的萤火虫荧光素酶载体、海肾荧光素酶载体和miR-520b类似物的荧光素蛋白相对表达量分别为17.13±0.58、25.06±0.74、29.31±4.43，低于空白对照组和阴性对照组的59.37±2.61、54.01±5.54，差异有统计学意义(P<0.01)。突变体组荧光素蛋白相对表达量为28.68±3.35，高于实验组的17.13±0.48，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3转染miR-520b类似物、抑制物对人血管内皮细胞IPO8表达的影响转染miR-520b类似物人血管内皮细胞IPO8蛋白相对表达量为0.39±0.07，低于类似物阴性对照组的0.92±0.16，差异有统计学意义(P<0.05)；转染特异性miR-520b抑制物后，血管内皮细胞中IPO8蛋白相对表达量为0.71±0.13，高于抑制物对照组的0.35±0.16，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.4miR-520b对人血管平滑肌细胞增殖的影响小RNA转染人血管平滑肌细胞，提升miR-520b表达后CCK8法检测细胞增殖吸光度均值为1.68±0.29，低于相应阴性对照的2.77±0.25，差异有统计学意义(P<0.05)；抑制miR-520b表达后吸光度值为2.97±0.15，高于相应阴性对照的1.91±0.09，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5miR-520b对人血管平滑肌细胞迁徙的影响提升miR-520b表达后人血管平滑肌细胞迁徙能力为8.65±0.93，低于相应阴性对照的19.75±1.28，差异有统计学意义(P<0.01)；抑制miR-520b表达后人血管平滑肌细胞迁徙能力为14.31±1.47，高于相应阴性对照的8.63±1.40，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

1为miR-520b抑制物组；2为抑制物阴性对照组；3为类似物阴性对照组；4为miR-520b类似物组；5为空白对照组图1 miR-520b对人血管内皮细胞中IPO8蛋白表达的影响

图2 Tranwells实验检测miR-520b对人血管平滑肌细胞迁徙能力的影响(×200)

3 讨论

动脉粥样硬化是常见的心血管系统病变，也是多种心脑血管病的病理基础。有研究显示，miRNA在动脉粥样硬化进展中发挥重要调控作用，如人动脉内皮细胞中，miR-155表达上调可降低氮氧化物合酶的分泌量和活性，引发细胞功能障碍〔5〕；而miR-125表达上调和miR-126表达下调会增加内皮细胞炎性蛋白分泌量〔6〕。近期研究显示，miR-520家族广泛参与炎症、再生障碍性贫血、肿瘤等病理生理过程〔7〕，但尚缺少在动脉粥样硬化过程中的作用研究。

本次研究显示，动脉粥样硬化患者血清miR-520b表达水平明显低于健康老年人；进一步靶基因筛查得到IPO8是miR-520b可能的作用靶基因，IPO家族是NF-κB核内移的关键转运蛋白，而核内移是NF-κB信号通路激活的必需步骤，该信号途径已被证实为血管内皮细胞相关炎症反应的一个重要途径。以此为基础本次研究将IPO8作为进一步研究的靶基因，并通过双荧光素酶检测证实其是miR-520b可通过调控IPO8的表达水平来抑制NF-κB信号通路激活，进而降低血管内皮细胞炎症反应。内皮细胞炎症激活会促进炎性因子、纤维生长因子等释放，进而刺激血管平滑肌细胞向合成型转换，引发血管中层平滑肌细胞向受损内膜的增殖、迁徙，引发血管内膜厚度增加、纤维化、斑块形成、闭塞。本次研究显示进一步证实了miR-520b过表达会抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁徙，对抗动脉粥样硬化。相关研究显示，阻断血管平滑肌细胞中IPO介导的NF-κB核内移，可抑制炎症反应〔8〕，但目前未见关于miR-520b能否影响人血管平滑肌细胞中IPO表达的报道，需深入研究。

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R541.4

1005-9202(2017)23-5801-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.022

河北省科学技术厅项目(20143217)