组织工程皮肤概况及其在化妆品检测中的应用进展

唐 洁 熊丽丹 综述,李 利,3 审校

(1.四川大学华西医院化妆品评价中心 四川 成都 610041；2.四川省化妆品工程技术研究中心 四川 成都 610041；3.四川大学华西医院皮肤科 四川 成都 610041)

•综 述•

组织工程皮肤概况及其在化妆品检测中的应用进展

唐 洁1,2熊丽丹1,2综述,李 利1,2,3审校

(1.四川大学华西医院化妆品评价中心 四川 成都 610041；2.四川省化妆品工程技术研究中心 四川 成都 610041；3.四川大学华西医院皮肤科 四川 成都 610041)

组织工程皮肤是通过培养功能细胞,将其与细胞外基质和适当的支架材料相互作用，构成的具有生物活性的人工皮肤替代物。本文简要介绍了构成组织工程皮肤的种子细胞及支架材料，并对其在化妆品腐蚀性安全性，化妆品刺激性安全性，化妆品成分的经皮吸收及致突变性，化妆品光毒性和化妆品抗衰老功效等检测应用方面的研究进展进行综述。

组织工程皮肤；种子细胞；支架材料；化妆品检测应用

组织工程(Tissue Engineering)是指结合生命科学与工程学两门学科的原理与技术，建立在认识哺乳动物的正常及病理两种状态的组织结构的基础上，研究开发组织或器官的生物替代物的一门新兴学科[1-3]。利用此类方法构建的皮肤模型则称为组织工程皮肤。目前系列化组织工程皮肤主要包含：表皮替代物模型，真皮替代物模型，含黑素瘤细胞皮肤替代物模型，全层皮肤替代物模型[4-6]，后来推广到仅有细胞组成的或仅有支架材料组成的组织工程化皮肤[3]。本文就组织工程皮肤应用于化妆品安全性检测的研究进展综述如下。

1 构建组织工程皮肤的种子细胞

目前，对于组织工程皮肤的种子细胞的选择主要有：来源于自体和异体的角质形成细胞[7-8]，成纤维细胞[9-10]，血管内皮细胞[10-11]，由于供体细胞的稳定性得不到保障，后来又添加了各类干细胞[7,12-13]等，这些组织工程皮肤中的种子细胞一般具有以下几个特征：①易获取；②增殖能力强；③能在体外进行扩增；④具有生物可降解性等特征。具体的种子细胞，见表1。

常见的用于组织工程皮肤的支架材料有胶原、壳聚糖、透明质酸及明胶等天然提取物。目前，侯亮等[17]对比了人骨髓间充质干细胞复合在聚四氟乙烯和硅胶两种材料中的生物相容性，杨荣强等[18]对通过物理、化学及生物方法去除动物皮肤组织中的表皮细胞及真皮层内细胞后，保留的低抗原性的胶原等细胞外基质蛋白和基质膜在组织工程支架材料上也进行了综述，这些都丰富了能够用于组织工程的支架材料。通过将种子细胞和支架材料合理的结合，各大化妆品公司或生物公司都提出了许多商品化的组织工程皮肤，具体如表2所示[3,5]。

表1 种子细胞应用举例

表2 部分目前商品化的体外表皮皮肤和全层皮肤替代物

2 组织工程皮肤在化妆品体外检测中的应用

目前，化妆品毒理学安全性评价方法主要采用豚鼠、家兔等作为受试动物，实验过程中，给这些动物带来巨大伤害和痛苦。于是禁止使用动物进行化妆品的测试于2009年被欧盟提出，同时欧盟组织也不允许其成员国进口经过动物实验检验的产品。因此，组织工程皮肤的出现，为化妆品安全性评价若干皮肤毒性替代实验方法研究起到了极大的推动作用，同时也为开展化妆品原料或成品毒理学方法研究，以及制定安全性评价替代实验方法技术指南提供了更为精准的实验模型。

2.1 建立化妆品腐蚀性安全性实验：2000年，欧莱雅公司下的EpiDerm和EpiSkin两款皮肤替代物产品得到欧委会正式的授权，作为活体兔皮肤的替代物，成为皮肤腐蚀性检测的工具，并在欧盟国范围内推行。紧接着，Mattek公司旗下EpiDerm皮肤替代物也获得了美国的批准，成为皮肤腐蚀性检测的工具。随后，组织工程皮肤在化妆品腐蚀性检测上取得了快速发展。张兆清等[19]利用组织工程学方法，采用Ⅰ型胶原为支架，种入人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞构建组织工程皮肤模型，检测了8种化学品的腐蚀性。刘珍等[20]采用包皮组织提取的原代细胞，鼠尾胶原为生物支架构建组织工程皮肤，通过组织细胞活性验证，快速渗透试验验证构建的皮肤模型，验证合格后，选用欧盟推荐检测使用的3种化学腐蚀性物质(正辛酸，10％KOH，丙烯酸)，非腐蚀性物质2种(四氯乙烯，丁香酚)进行测试。根据建立的方法，检测了39种化妆品进行皮肤腐蚀性、刺激性检测。使用组织工程皮肤进行腐蚀性实验，方法简单快速，减少了对动物的伤害，但该模型的准确性不够，需要进一步提高。

2.2 建立化妆品刺激性安全性实验：相较于化妆品的皮肤腐蚀性实验，皮肤刺激性实验不仅仅需要测量毒理，同时需要测定细胞因子和酶释放等代谢指标。据此，欧盟给出了检测指南TG431，推荐使用MTT法检测组织细胞毒理。后来在实际研究过程中，发现MTT方法虽然特异性好，但灵敏度不够高，为了提高受试物的刺激性检测结果的可靠性，又添加了炎症介质IL-1，IL-8，TNF-α，IL-10和PGF-2等检测指标，采用这类多通道多指标检测为化妆品刺激性实验提供更为可靠的数据。这些指标的合用，为之后ECVAM第26届欧洲委员会大会提出对于待测物刺激性评价指标的判定标准(EEC/R38)提供了前期的数据和研究支持。在一系列规范化的判定标准出台后，国内许多科研工作者都在化妆品刺激性检测领域做出了进一步的验证。刘珍等[20]采用鼠尾胶原为支架，人包皮组织分离的表皮和真皮后的原代细胞为种子细胞，共同培养建立皮肤模型，并应用于39种化妆品的刺激性安全检测，所得到的结果与采用欧盟标准方法得到的结果一致。张广静等[21]使用了两种细胞为种子细胞，分别为原代培养的细胞及永生化的细胞构建组织工程皮肤模型，对比采用这两种不同种子细胞的皮肤模型对20种化妆品配方常用物质及化学常用物质进行皮肤刺激性检测的相关研究，通过IC50和IL-1α两个指标的评定，同时与EpiDerm和Episkin评价的结果对比，表明构建的两种模型都能很好地检测出物质的刺激性和非刺激性。诸多实验结果表明，组织工程皮肤用于化妆品刺激性检测能得到可靠结果，同时大量减少了用于化妆品刺激性实验的动物数目。Casas等[22]使用EpiDerm皮肤模型替代动物模型进行刺激性实验。

2.3 研究化妆品成分的经皮吸收和致突变性：目前化妆品市场有很大一个份额为药妆品牌市场，这类化妆品成分中的许多功效性成分能否透过皮肤达到作用的目标靶点以及透过的准确量仍然没有一个准确的体外实验方法。因此，对于体外实验中组织工程皮肤的出现就引起了许多化妆品研究从业人群的极大关注。Gabbanini等[23]使用组织工程皮肤SkinEthic®对化妆品中常见的8种成分：茴香脑、香芹酮、薄荷酮、薄荷醇、芳樟醇、侧柏酮、桉叶素及卡波分别进行透皮实验，然后通过动力学分析结果，并与GC/HPLC-MS仪器结果做对比，结果可靠。目前，纳米化妆品在市场上吸引了厂家和消费者的注意，但原料达到纳米尺寸，其许多物理和化学性质，诸如纳米尺寸效应等，则与常规尺度的原料有很大的区别。许多化妆品，诸如防晒剂等，正是看中了纳米材料的这个物理性质，有不同浓度的添加。刘珍等[20]利用重组人皮肤模型，在皮肤模型下层设置一层靶细胞(L5178Y)，通过一个间接实验，测定纳米TiO2材料的经皮吸收和其致突变性。Pfuhler等[24]也采用EpiDerm皮肤模型和化妆品接触一段时间后，分析细胞DNA的损伤情况，从而将其应用到化妆品的遗传毒性的检测中。

2.4 研究化妆品光毒性：正常皮肤长时间暴露于潜在的有害照射下，可能会导致某些皮肤疾病，对于暴露于光照下的皮肤细胞，人体黑素细胞将产生黑素，并通过树突传到周围的角质细胞内，因此，用于体外化妆品的组织工程皮肤的种子细胞大多具有黑素细胞以及角质细胞的存在。而化妆品的体外光毒性(Phototoxicity)是指皮肤接触到某些化妆品内的化学品后，在太阳光或紫外线的照射下，发生的急性毒性反应。目前，光毒性检测的体外替代方法主要是利用细胞、组织或者器官模型进行筛选[25]，例如3T3中性红摄入法等。Bernerd等[26]将自建的组织工程皮肤暴露于不同波段的UVB及UVA辐照，实验结果显示，在体外模拟人皮肤环境下，UVA和UVB对于皮肤的不同结构层的伤害是不一样的，同时能够模拟防晒化妆品涂抹皮肤的实验过程。总得来说，组织工程皮肤应用于化妆品光毒性检测具有以下优点[27]：①可以模拟皮肤局部用药；②具有角质层屏障，光照后产生的化合物和分子吸收剂渗透结果更为接近人体正常皮肤，结果更为可靠。

2.5 研究化妆品抗衰老功效：将化妆品涂于组织工程皮肤模型上，通过检测相关指标，如清除自由基能力，抗氧化能力和胶原蛋白含量等指标，可以考察化妆品对细胞增殖分化及抗氧化能力的影响。Grazul等[28]将保湿面霜涂于EpiDerm模型上，进行了氧自由基吸收能力的测定。Santa-Maria等[29]采用组织工程皮肤作为模型，发现米糠原料中水溶性酶类具有降低脂质过氧化值的作用。相对于直接使用皮肤细胞进行实验，组织工程皮肤模型上进行抗衰老的功效性评价更能反映生物体的真实状态。

3 总结和展望

组织工程皮肤在化妆品体外评价领域具有良好的应用前景，但也存在着多细胞共培养技术不成熟，组织结构相对真实皮肤结构较为简单，各细胞层分化不良以及部分标志物不规则表达的缺点，因此还需要进一步的调整三维细胞培养技术。目前，组织工程皮肤的临床应用有望在口腔、皮肤等各类疾病的治疗上得到更广泛的应用。

[1]Nerem RM.Tissue engineering in the USA[J].Med & Biol Eng &Comput,1992,30:CE8-CE12.

[2]Bello YM,Falabella AF,Eaglstein WH. Tissue-Engineered Skin[J].Am J Clin Dermatol,2001,2(5):305-313.

[3]杨维,崔占峰.组织工程皮肤发展现状[J].中国科学,2015,45(5):460-470.

[4]卢永波,张勇杰,金岩.组织工程皮肤技术及化妆品体外科学检测的发展[J].北京日化,2016,38(3):26-31.

[5]Groeber F,Holeiter M,Hampel M,et al.Skin tissue engineering-In vivo and in vitro applications[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,39(1):33-58.

[6]叶藤,卢彬,陆洪光.MV3和HaCaT细胞接种去表皮真皮组织上构建人工皮肤黑素瘤模型[J].中国组织工程研究,2013,17(37):6620-6627.

[7]Ferraris C,Chevalier G,Favier B,et al. Adult corneal epithelium basal cells possess the capacity to activate epidermal,pilosebaceous and sweat gland genetic programs in response to embryonic dermal stimuli[J].Development,2000,127(24):5487-5495.

[8]Eaglstein WH,Falanga V.Tissue engineering and the development of Apligraf®,a human skin equivalent[J].Clin Ther,1997,19(5):894-905.

[9]Narong S,Leelawat K. Basic fibroblast growth factor induces cholangiocarcinoma cell migration via activation of the MEK1/2 pathway[J].Oncol Lett,2011,2(5):821-825.

[10]Kunz-Schughart LA,Schroeder JA,Wondrak M,et al.Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessellike structures from endothelial cells in vitro[J].Am J Physiol-Cell Ph,2006,290(5):C1385-C1398.

[11]O'Ceallaigh S,Herrick SE,Bluff JE,et al.Quantification of total and perfused blood vessels in murine skin autografts using a fl uorescent double-labeling technique[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):40-151.

[12]Troy TC,Turksen K.Commitment of embryonic stem cells to an epidural cell fate and differentiation in vitro[J].Dev Dynam,2005,232(2):293-300.

[13]Limat A,Mauri D,Hunziker T.Successful treatment of chronic leg ulcers with epidermal equivalents generated from cultured autologous outer root sheath cells[J].J Invest Dermatol,1996,107(1):128-135.

[14]Limat A,Noser FK.Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair-follicles[J].J Invest Dermatol,1986,87(4):485-488.

[15]Sriwiriyanont P,Lynch KA,McFarland KL,et al. Characterrization of hair follicle development in engineered skin substitutes[J].PLoS One,2013,8(6):e65664.

[16]Jeremias TS,Machado RG,Visoni SB,et al.Dermal Substitutes Support the Growth of Human Skin-Derived Mesenchymal Stromal Cells: Potential Tool for Skin Regeneration[J]. PLoS One,2014,9(2):e89542.

[17]侯亮,张扬,孙轶峰,等.人骨髓间充质干细胞复合两种填充材料体外生物相容性的比较[J].中国美容医学,2017,26(7):48-52.

[18]杨荣强,崔正军.异种脱细胞真皮基质临床应用研究与进展[J].中国美容医学,2017,26 (9):132-135.

[19]张兆清,金岩,余春艳,等.化学腐蚀性组织工程皮肤检测模型的构建[J].中国生物工程杂志,2005,25(11):81-83.

[20]刘珍,张天宝.化妆品安全性评价中皮肤毒性若干替代实验方法的研究[D].上海:第二军医大学,2009.

[21]张广静,卢涛,金岩.利用体外构建的组织工程皮肤模型进行皮肤刺激性检测的相关研究[D].河北:河北联合大学,2011.

[22]Casas JW,Rankin EA.In vitro human skin irritation test for evaluation of medical device extracts[J].Toxicol In Vitro,2013,27(8):2175-2183.

[23]Gabbanini S,Lucchi E,Carli M,et al. In vitro evaluation of the permeation through reconstructed human epidermis of essentials oils from cosmetic formulations[J]. J Pharm Biomed Anal,2009,50(3):370-376.

[24]Pfuhler S,Fautz R,Ouedraogo G,et al.The cosmetics europe strategy for animal-free genotoxicity testing: project status up-date[J].Toxicol In Vitro,2014,28:18-23.

[25]Schaum KD. 2007 Update: Skin Replacement and Skin Substitute Application Codes[J]. Adv Skin Wound Car,2007,20(5):267-268.

[26]Bernerd F,Asselineau D.An organotypic model of skin to study photodamage and photoprotection in vitro[J].J Am Acad Dermatol,2008,58(5,Supplement 2):S155-S159.

[27]邹运动,曹玉萍,郑洪艳,等.基于组织工程皮肤的化学品光毒性检测[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(11):2147-2150.

[28]Grazul-Bilska AT,Bilski JJ,Redmer DA,et al. Antioxidant capacity of 3D human skin EpiDerm model: effects of skin moisturizers[J].Int J Cosmetic Sci,2009,31(3):201-208.

[29]Santa-María C,Revilla E,Parrado J,et al.Protection Against Free Radicals (UVB Irradiation) of a Water-Soluble Enzymatic Extract from Rice Bran. Study Using Human Keratinocyte Monolayer and Reconstructed Human Epidermis[J].Food Chem Toxicol,2010,48(1):83-88.

Overview of Tissue Engineering Skin and It´s Application in Cosmetics Test

TANG Jie1,2,XIONG Li-dan1,2,LI Li1,2,3
(1.Center of Cosmetic Safety and Ef fi cacy Evaluation,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;2.Engineering Technology Research Center of Cosmetic in Sichuan,Chengdu 610041,Sichuan,China;3.Department of Dermatology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China)

Tissue engineered skin is a biologically active arti fi cial skin substitute,which is formed by the interaction of the extracellular matrix and the appropriate scaffold materials with the functional cells. This paper briefly introduces several composition speccies of seed cells and scaffold materials of tissue engineering skin,Besides,this article also reviews the application progress of tissue engineering skin in cosmetic corrosion safety,cosmetic irritant safety,cosmetic percutaneous absorption and mutagenicity of cosmetics,light toxicity and cosmetic anti-aging ef fi cacy testing.

tissue engineered skin; seed cells; scaffold; cosmetic testing

R456

A

1008-6455(2017)11-0132-03

李利,四川大学华西医院皮肤科/化妆品评价中心教授、主任医师；研究方向：损容性皮肤病(色素性、血管性皮肤病、痤疮等)，皮肤老化及光老化，皮肤保健与美容，皮肤美容激光等；E-mail:lily_hxyy@163.com

2017-08-08

2017-10-23

编辑/李阳利