miR-143在PTC患者中的表达与对患者免疫功能的影响①

江 珊 林 梃 陈幸生

(福建医科大学附属协和医院甲状腺外科 ，福州 350005)

miR-143在PTC患者中的表达与对患者免疫功能的影响①

江 珊 林 梃 陈幸生

(福建医科大学附属协和医院甲状腺外科 ，福州 350005)

目的研究miR143的表达水平与甲状腺乳头状瘤患者(PTC)预后、细胞生物学特性之间的关系，并对相应机制进行探讨。方法首先使用QPCR检测30例PTC患者癌组织、癌旁组织中miR143的表达水平，并同时调取TCGA数据库中PTC患者生存信息，并检测miR143对生存率与转移率的影响。PTC细胞系IHH-4随后分别转染CON与pGenesil1-miR143载体，48 h后QPCR检测miR143的变化水平，CCK8法检测细胞增殖、Annexin V/PI法检测细胞凋亡、Transwell法检测细胞迁移。随后检测2013年4月至2016年12月之间收治的200名甲状腺乳头状癌患者血清中miR143、IL-10、IFN-γ，并计算皮尔森积矩系数，最后，将患者分为miR143高表达与低表达组，并计算IL-10、IFN-γ的表达量。结果miR143在癌旁组织与癌组织中的相对表达量分别为(1.0±0.15) vs (0.12±0.06)，miR143的表达同时与患者生存率、转移率密切相关(P<0.001)。IHH-4 pGenesil1-miR143与CON组的miR143表达水平分别为8.63±0.71 vs 1.0±0.06，在48 h时，pGenesil1-miR143组增殖指数显著低于CON(P<0.01)，pGenesil1-miR143组与CON组Annexin V+阳性细胞比例分别为(40±7.2) vs (2±0.38)，迁移细胞数的比值分别为(40±7.2) vs( 2±0.38)，以上P值均小于0.001。在PTC患者中，IL-10、IFN-γ中，r2分别为-0.4，0.62(P<0.001)，miR143低表达组与高表达组IFN-γ的表达量分别为(8±0.23) vs (11.2±0.12)，IL-10(12±3.1) vs (8.43±0.44)(P<0.05)。结论miR143在PTC患者中低表达，且与患者预后、生存相关。miR143 的高表达使得IHH-4细胞系增殖减弱、凋亡增加、迁移降低，同时miR143的表达与患者的免疫功能相关。

甲状腺乳头状瘤;miR143;免疫;IL-10；IFN-γ

甲状腺乳头状瘤(Papillary thyroid carcinoma ，PTC)是甲状腺肿瘤中最常见的一种，占甲状腺肿瘤的70%，在过去的十年中，PTC的发病率在全球范围不断上升，因而PTC的发病机制也越来越受到关注[1]。PTC的发病机制尚不清楚，主要与环境、基因以及内分泌因素相关，例如在1986年切尔诺贝利核电站泄漏事故之后，PTC的发病率大幅上升，其中儿童由于甲状腺处于生长高峰期而发病率最高[2]。尽管PTC最为常见，通常PTC的预后较好，然而其中10%的患者出现癌症的复发以及远隔器官的转移，从而使得患者的预后变差，因此寻找预后较差的患者的基因表达、突变差异成为近年来研究的热点[3]。

在PTC中，特定基因能够显著影响PTC的进展， microRNAs (miRNAs)是一组19～25 nt的RNA分子，并通过与mRNA的结合来达到转录后调控的目的[4]，miRNA在PTC中的作用已被证实，例如miR-146a与 miR-146b在PTC组织中高表达，并与患者的甲状腺外扩展、TNM分期显著相关[5]。而与之相反，miR143在癌症中普遍低表达，miR143位于人基因组第5染色体，与miR-145编码区域接近，miR143在多种肿瘤中如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌中低表达，且与疾病的进展相关，而miR143在PTC中的作用则尚未有报道[6-8]。

1 材料与方法

1.1材料 人PTC样本及其相应癌旁组织来自福建医科大学附属协和医院，样本收集过程得到福建医科大学附属协和医院伦理委员会批准，PTC细胞系IHH-4购自北京协和医学院实验中心，miR143前体序列引物由北京奥科鼎盛合成，pGenesil-1质粒由本室保藏，脂质体购自美国Invitrogen公司，Tri-zol购自美国invitrogen公司，RNA反转录试剂盒与TAKARA SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒购自大连宝生生物公司(Takara)，Transwell小室购自美国corning公司， CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司，细胞凋亡检测试剂盒购自天津三箭生物技术公司。

1.2方法

1.2.1pGenesil1-miR143合成以及靶基因预测 miR143前体序列合成引物为forward：5′-ATAGGATCCGCGCAGCGCCTGTCTCCCAGCCT,reverse：5′-ATAAAGCTTGCTGCAGAACAACTTCTCTCTTCC,PCR扩增后，与pGenesil-1质粒连接，测序验证载体后进行后续实验，miR143靶基因预测使用TargetScan网站(http://www.targetscan.org/vert_71/)。

1.2.2细胞培养与分组 PTC细胞系IHH-4培养于37℃、5%CO2孵箱中，培养基为DMEM+10%FBS，将细胞分为CON与pGenesil1-miR143组，分别使用脂质体转染CON与pGenesil1-miR143载体，脂质体转染步骤根据invitrogen公司说明书进行。

1.2.3Q-RT-PCR 细胞总RNA提取使用酚-氯仿抽提法，(1)细胞使用Tri-zol裂解后，加入0.5倍体积氯仿，剧烈震荡后15 000 r/min、15 min离心，取上清。(2)加入等体积异丙醇，冰上沉淀20 min后，12 000 r/min、10 min离心，取沉淀。(3)沉淀使用75%酒精洗2次，即得到细胞总RNA。细胞总RNA随后使用TaKaRa 反转录试剂盒反转录为cDNA，操作步骤根据TaKaRa反转录试剂盒说明书进行，cDNA使用TAKARA SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒检测，miR143引物序列为：forward： 5′- ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3′，reverse： 5′- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，内参引物GAPDH forward 5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG -3′,reverse 5′- GGGACGACCTTCGATCTACC -3′，使用2-ΔΔCt检测miR143 mRNA的表达水平。

1.2.4细胞增殖检测 细胞增殖检测使用CCK8法，将IHH4 CON与IHH4 pGenesil1-miR143细胞铺于96孔板中，5 000/孔，同时设立复孔，待细胞贴壁后，加入0.1体积的CCK8试剂，避光37 ℃ 孵育 3 h后，使用酶标仪检测OD450 nm吸光度，以0 h的度数为基准，计算24、48、72与0 h的比值，即细胞增殖系数。

1.2.5细胞凋亡检测 细胞凋亡使用Annexin V/PI法检测，IHH-4细胞消化后，使用PBS洗2次，并使用富含Ca2+的binding buffer洗1次，binding buffer重悬后，加入Annexin V抗体，冰上孵育10 min后，加入PI染料，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。

1.2.6细胞迁移检测 采用Transwell小室检测细胞迁移能力，Transwell下室加入600 μl完全培养基(DMEM+10%FBS)，上室加入含有1×106细胞的200 μl细胞悬液，12 h后，除去小室上方细胞，下方细胞使用结晶紫染色，显微镜20倍视野下对穿过小室的细胞进行计数，实验重复3次并取平均值。

1.2.7生存曲线以及皮尔森相关系数计算 PTC患者生存曲线数据来源于TCGA公共数据库，以患者基因表达水平的平均值分组，并使用R语言中survival包进行生存分析，ggplot2包绘制生存曲线，皮尔森相关系数使用R语言自带分析包计算。

1.3统计学分析 实验数据使用SPSS20.0进行统计学分析，统计学方法为配对t检验，P<0.05即认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1miR143在PTC患者中高表达，且与预后相关 在提取30例PTC患者癌组织及相应癌旁组织RNA后，使用QPCR检测miR143在RNA水平的表达差异，结果表明miR143在癌旁组织中的相对表达量为(1.0±0.15)，显著高于癌组织中(0.12±0.06)，P<0.001，差异具有统计学意义(图1A)，同时将TCGA中甲状腺乳头状癌患者按照平均值将患者miR143高表达组与低表达组，对miR143表达水平与预后之间关系进行生存分析后发现，miR143高表达使得患者整体生存率(图1B、2B)与转移率大大降低，P<0.001，表明miR143对患者预后以及转移均有显著影响。

图1 miR143在PTC患者中表达Fig.1 Expression of miR143 in PTC patientsNote: A.QPCR to detect the miR143 expression level in cancer tissues and adjacent tissues(***.P<0.001)；B.Analysis of overall survival rate in high expression group and low expression group based on miR-143 expression；C.Analysis of metastasis-free survival rate.

2.2miR143调控IHH-4细胞增殖、凋亡、迁移 CON与pGenesil1-miR143转染PTC细胞系IHH-4 48 h后，使用QPCR检测miR143表达水平的变化，结果表明IHH-4 pGenesil1-miR143表达水平为(8.63±0.71)，显著高于对照组的(1.0±0.06)(图2A)，随后使用CCK8检测增殖能力的变化后发现，在48 h时，pGenesil1-miR143组增殖指数显著低于CON，且在72 h时差异进一步扩大，P<0.01(图2B)，而在转染48 h时，使用Annexin V/PI法检测细胞凋亡的变化后发现，pGenesil1-miR143组Annexin V+阳性细胞比例为(40±7.2)，显著高于CON组的(2±0.38)(图2C)，而使用Transwell评估细胞迁移能力的变化后发现，CON组迁移细胞数的比值为(1±0.12)，显著高于pGenesil1-miR143组的(0.21±0.10)(图2D)，以上P值均小于0.001，差异具有统计学意义。

图2 miR143调控IHH-4细胞增殖、凋亡、迁移Fig.2 miR143 regulated IHH-4 cell proliferation,apopto-sis and migrationNote: A.CON and pGenesil1-miR143 plasmids were transfected into IHH-4 for 48 h,and qPCR was performed to detect the change of miR-143 expression(***.P<0.001)；B.CON and pGenesil1-miR143 plasmids were transfected into IHH-4 for 48 h,and CKK8 was performed to assess the change of cell proliferation(**.P<0.01,***.P<0.000 1)；C.Annexin V/PI assay to detect the change of cell apoptosis；D.Transwell assay to detect the change of cell migration.

图3 miR143与PTC患者免疫功能相关Fig.3 miR143 is related with PTC patients′ immune functionNote: A.Pearson correlation coefficient analysis.Correlationship of miR143 and other factors (IL-10 and IFN-γ) from 200 cases of PTC patients which admitted from April 2013 to December 2016;B.Analysis of IL-10 and IFN-γ expression in groups of miR143 high expression and low expression.

2.3miR143与PTC患者免疫功能相关 在确定了miR143的作用后，随后检测本院2013年4月至2016年12月之间收治的200名甲状腺乳头状癌患者血清中miR143、IL-10、IFN-γ表达水平，并通过计算皮尔森相关系数评估miR143与IL-10、IFN-γ之间的关联，结果表明在IL-10、IFN-γ中，r2分别为-0.4，0.62，P值均小于0.001，表明miR143与IL-10表达呈负相关、IFN-γ表达呈正相关(图3A)，随后将患者按照miR143表达量分为miR143高表达与低表达组，计算IL-10、IFN-γ的表达量后发现，两组IFN-γ的表达量分别为(8±0.23) vs (11.2±0.12)，IL-10(12±3.1) vs (8.43±0.44)(图3B)，差异具有统计学意义，P<0.05。

3 讨论

尽管大部分PTC患者的预后较好，仍然有一定比例的患者出现反复发作与转移，使得预后明显变差，因此明确预后较差患者中的基因表达情况，并制定特殊的靶向治疗手段成为研究的热点，miRNA 对PTC的调控已被报道，其中研究最为透彻的为miR-221/222与miR-146，二者均在PTC中显著上调且与疾病进展相关[9]，miR143是一种在癌症中下调的miRNA，miR143对于肿瘤的作用十分复杂，在前列腺癌中，miR143主要通过负调控ERK5从而改变前列腺癌特异性标志物的水平[10]，在结肠癌中，miR143则通过抑制结肠癌细胞系SW-480的增殖、促进凋亡并阻滞细胞周期而发挥作用[11]，而miR143与PTC的联系则尚未有报道，生物信息学显示促甲状腺激素受体可能是miRNA-143下游靶基因之一，而促甲状腺激素与受体结合后，可间接刺激甲状腺上皮细胞分泌多种与恶性肿瘤生长密切相关的细胞生长因子，包括肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子及胰岛素样生长因子等，促进甲状腺癌细胞增殖及新生血管的发生[12]，提示miRNA-143可能与PTC密切相关。

在本研究中，首先检测了30例PTC患者癌组织以及对应的癌旁组织中miR143的表达，结果表明miR143在PTC癌组织中表达显著下降，证实了在癌组织中miR143降低，同时从TCGA数据库中调取PTC患者临床信息，按照miR143表达量的平均值分为高表达与低表达组后，对患者进行生存分析，结果表明miR143高表达组患者生存率与转移均优于低表达组患者，以上结果初步证实了miR143在肿瘤中的低表达，且miR143的表达水平与患者的生存、转移密切相关，而在癌症的基因突变中，仅有小部分突变为驱动基因突变，更多的则是与癌症无关的“乘客基因”突变[13]，因此随后将pre-miR143克隆至pGenesil1表达载体中，并转染至PTC细胞系IHH-4，QPCR确定miR143过表达后，使用CCK8方法检测IHH-4增殖的变化，结果表明miR143的过表达使得IHH-4细胞增殖减弱，随后使用Annexin V/PI检测凋亡、Transwell检测迁移后发现，miR143的过表达同时促进凋亡并抑制了增殖，以上结果表明miR143的低表达对PTC细胞系IHH-4生物学特性的维持至关重要，也证实了miR143的抑癌作用，而在文献的报道中，miR143能够受到TCGF-β1、RBM3等基因的调节从而对癌细胞的免疫逃逸发挥作用，因此随后使用皮尔森相关系数评估200名患者中miR143与免疫通路因子的关联，结果表明在th1/th2通路相关分子中，miR143表达与IL-10的表达呈负相关，并与IFN-γ的表达呈正相关，IL-10与IFN-γ均为已知的多效性分子，分别属于th2与th1型细胞因子，而IL-10等th2细胞因子的表达能够抑制th1细胞因子的产生[14]，因此miR143与PTC患者中th1、th2因子的平衡相关，为了进一步验证这一点，随后将200名PTC患者按照miR143表达平均值分为高表达与低表达组，随后检测两组患者IL-10、IFN-γ的表达水平，结果表明在IL-10中，miR143低表达使得IL-10表达升高，而在IFN-γ中则呈现了相反的趋势，根据以上结果，可以得出结论，miR143的低表达能够使得患者IL-10升高、IFN-γ降低，患者th1向th2偏移，在PTC患者中，已有文献证实肿瘤患者IL-10升高、IFN-γ降低，出现th1/th2迁移现象，除此之外，在肿瘤的发生发展中，IL-10、IFN-γ是已知的与肿瘤相关的因子，IL-10的升高一方面能够通过对HLA-G上调以及对HLA-Ⅰ进行下调来达到对免疫抑制环境的诱导[15]，在宫颈癌中能够使得肿瘤细胞逃脱T淋巴细胞的裂解作用[16]，在细胞生物学特性中，IL-10能够通过MAPK、NF-κB通路影响增殖，同时肿瘤相关巨噬细胞分泌的IL-10可能通过激活肿瘤细胞中的STAT3通路来达到抑制肿瘤细胞凋亡、迁移的作用[17]，因此miR143对PTC的作用与对免疫功能的改变相关，同时能够通过改变IL-10的表达来达到调控细胞凋亡、增殖与迁移的作用，本实验初步证实了miR143在PTC患者肿瘤组织中低表达，并且与患者的总体生存率以及转移生存率相关，同时miR143的高表达与PTC细胞的凋亡、增殖与迁移密切相关，而miR143的作用机制与抑制IL-10相关，为相关靶向药物的开发提供了依据。

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ExpressionofmiR-143inpatientswithPTCanditsinfluenceonimmunefunction

JIANGShan，LINTing，CHENXing-Sheng.

ThyroidSurgery,FujianMedicalUniversityUnionHospital,Fuzhou350005,China

Objective:To investigate the relationship between the expression level of miR143 and prognosis/cellular biological characteristics in patients with papillary thyroid carcinoma (PTC),and explore the potential mechanisms.Methods30 PTC patients were admitted and enrolled into the trial from 2013 April to 2016 December.The qPCR was performed to detect the expression of miR143 in cancer tissues and adjacent tissues from 30 PTC patients.The effect of miR143 on overall survival rate and metastasis-free survival rate was assessed with specific analysis.CON and pGenesil1-miR143 vector were transfected into PTC cell line IHH-4 48h after qPCR.CKK8 and Annexin V/PI flow cytometry were performed to detect cell proliferation,and apoptosis,respectively.Cell migration was asseessed by transwell experiment.Levels of miR143,IL-10,IFN-γ in serum were assessed and calculated with the pearson coefficient.PTC patients were assigned into miR143 high and low expression group according to miR143 expression,and IL-10 and IFN-γ were measured with routine protocol.ResultsThe relative expression of miR143 in paracancerous tissues and tumor tissues was (1.0±0.15) vs (0.12±0.06).miR143 was significantly associated with the survival rate and metastasis rate of patients (P<0.001).miR143 expression levels in IHH-4 pGenesil1-miR143 and control group were (8.63±0.71) vs (1.0±0.06),and the proliferative index in pGenesil1-miR143 group was significantly lower than CON group(P<0.01).Percentage of Annexin and V+ positive cells in pGenesil1-miR143 and CON group was (40±7.2) vs (2±0.38),and the ratio of the number of migrating cells was (40±7.2) vs (2±0.38) (P<0.001).Analysis showed thatr2were -0.4 and 0.62 for IL-10 and IFN-γ,respectively(P<0.001).In miR143 low group and high expression group,expression levels of IFN-γ was (8±0.23) vs (11.2±0.12),while IL-10 was (12±3.1) vs (8.43±0.44) (P<0.05).ConclusionmiR143 is low expressed in PTC patients and associated with prognosis and survival.Highly expressed miR143 inhibited the proliferation of IHH-4 cell lines,increased apoptosis and decreased migration,also the expression of miR143 is related to the immune function of the patients.

Thyroid papillary tumor;miR143;Immunization;IL-10;IFN-γ

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.022

R730.23

A

1000-484X(2017)12-1862-05

①本文为福建省科技计划项目(No.2017Y0036)。

江 珊(1977年-)，男，副主任医师，主要从事甲状腺外科学方面的研究，E-mail：hsh5626@163.com。

[收稿2017-07-06 修回2017-10-18]

(编辑 许四平 刘格格)