血必净注射液治疗火器致兔ALI的康复价值及对肺组织NF—κB表达的影响

徐晓峰++许秀娟+++郝建++吴升++钱钧++李树雯++李霄茜

[摘要] 目的 探討血必净（XBJ）注射液治疗火器致兔急性肺损伤（ALI）的康复价值及对肺组织核因子-κB（NF-κB）表达的影响。 方法 采用随机数字表法将SPF级健康雄性兔60只分为正常对照组、ALI模型组、生理盐水组、低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组，每组各10只。ALI模型组、生理盐水组、低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组吸入高温气体，制作完成兔ALI动物模型；建模半小时后，低、中、高剂量XBJ治疗组分别腹腔内注射10、20、30 mg/kg XBJ，生理盐水组注射生理盐水，正常对照组和ALI模型组不做处理。观察12 h后，处死兔并取左肺上叶肺组织，检测肺组织NF-κB的表达；在光镜下对肺组织进行病理学检查，并及时记录其病理变化。 结果 病理学检查结果：正常对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液；ALI模型组、生理盐水组肺泡结构模糊，肺泡壁断裂，肺内大量炎症细胞浸润，肺组织间质及肺泡腔出现明显水肿，可见较多的红细胞，肺泡壁间质增厚，透明膜形成；经XBJ治疗的各组肺泡结构仍存在，肺内炎症细胞浸润减轻，肺组织间质及肺泡腔中度水肿，可见少量渗液、出血。肺组织Western blot分析显示，ALI模型组NF-κB活性明显高于正常对照组（P < 0.01）；与ALI模型组、生理盐水组比较，低、中、高剂量XBJ治疗组兔肺组织中NF-κB活性明显降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），其中，中剂量XBJ治疗组降低最明显，与低、高剂量XBJ治疗组比较差异均有统计学意义（P < 0.05、P < 0.01）。 结论 XBJ注射液对火器伤诱导兔的ALI具有保护作用，且XBJ中剂量保护作用最明显。

[关键词] 急性肺损伤；血必净注射液；核因子-κB；细胞因子

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（a）-0019-05

The value of Xuebijing Injection on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury induced by firearm injury and the effect on the expression of NF-κB in lung tissue

XU Xiaofeng XU Xiujuan HAO Jian WU Sheng QIAN Jun LI Shuwen LI Xiaoqian

Cardiopulmonary Rehabilitation Medicine Center， Hangzhou Sanatorium of People's Liberation Army， Zhejiang Province， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To investigate the value of Xuebijing Injection （XBJ） on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury （ALI） induced by firearm injury and the effect on the expression of nuclear factor kappa B （NF-κB） in lung tissue. Methods Sixty healthy male rabbits were randomly divided into normal control group， ALI model group， normal saline group， low dose of XBJ treatment group， medium dose of XBJ treatment group， high dose of XBJ treatment group by random number table mehtod， with 10 rats in each group. The rabbits of ALI model group， normal saline group， low dose of XBJ treatment group， medium dose of XBJ treatment group， high dose of XBJ treatment group were inhaled with high-temperature gas， so as to complete the model of rabbits with ALI. After modeling for half an hour， low， medium， high dose of XBJ treatment groups were respectively received intraperitoneal injection of 10， 20， 30 mg/kg XBJ， normal saline group was injected with normal saline， while normal control group and ALI model group were not dealt with any treatment. After 12 h， the rabbits were killed and the lung tissue of left upper lobe was taken to detect the expression of NF-κB in lung tissue； under the light microscope， the lung tissue was taken to make pathological examination， and the pathological changes were recorded in time. Results The results of pathological examination： in the normal control group， the alveolar structure was clear， the alveolar wall was thin， and no edematous fluid was found in the lung tissue； in the ALI model group and normal saline group， the alveolar structure was fuzzy， the alveolar wall was broken， there were a lot of inflammatory cells infiltration in the lung， obvious edema was found in the pulmonary mesenchyme and alveolar space， many red blood cells could be seen， and the mesenchyme of alveolar wall was thickened， the hyaline membrane was formed； after treatment by XBJ， the alveolar structures in all groups were still existed， the inflammatory cells infiltration in the lung was reduced， pulmonary mesenchyme and alveolar space showed moderate edema， less cataclysm and bleeding could be seen. Western blot of lung tissue showed that， the activity of NF-κB in ALI model group was significantly higher than that of normal control group （P < 0.01）； compared with ALI model group and normal saline group， the activity of NF-κB in lung tissue of low， medium， high dose of XBJ treatment groups were all decreased， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）， among which， medium dose of XBJ treatment group was decreased most significantly， which had statistically significant differences compared with those of low， high dose of XBJ treatment groups （P < 0.05， P < 0.01）. Conclusion XBJ injection has protective effects on rabbits with ALI induced by firearm injury， and the protective effect of medium dose of XBJ is the most obvious.endprint

[Key words] Acute lung injury； Xuebijing Injection； Nuclear factor kappa B； Cytokines

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是机体受到感染、误吸、创伤和脓毒症等致病因素损伤以后，肺组织产生的广泛而过度的炎性反应，病理学特点是肺组织出现大量的炎症细胞浸润和肺血管通透性增加，其发病机制复杂，病死率高，是近年来研究的热点。近年来在动物实验中研究发现使用血必净（XBJ）注射液对大鼠ALI具有保护作用[1]，因此，本研究选用火器伤制作兔ALI模型，采用XBJ干预治疗，测量兔肺组织中核因子-κB（NF-κB）的活性，旨在探讨XBJ注射液治疗火器致兔ALI康复价值及对肺组织NF-κB表达的影响，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

由安徽医科大学附属省立医院动物实验中心提供SPF级健康兔60只，雄性，体重1.80～2.20 kg，月龄1～4个月，合格证号为101193，伦理审批批号为20140319。

1.2 主要实验试剂

XBJ注射液由上海第一生化药业有限公司生产，生产批号20150911，每支10 mg（2 mL）。NF-κB免疫印迹检测试剂盒由上海博苑生物科技有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 将SPF级健康雄性兔60只采取随机数字表法分为六组：正常对照组、ALI模型组、生理盐水组、低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组，每组各10只。

1.3.2 动物模型制作及处理 使用中国科学技术大学火灾国家重点实验室研制的高温气体实验装置完成模拟火器伤致兔ALI实验动物模型[2]。具体方法：将各组兔称重并记录体重数据，除正常对照组兔外，其余各组均用400 mg/kg的10%水合氯醛注射液注入至实验兔的腹腔中进行麻醉，将麻醉好的兔放置在高温气体实验装置内，启动点火，调节实验模型装置内可变温度至150℃高温气体供给兔吸入，整个ALI的实验时间控制在3 min，完成兔ALI的动物模型。造模成功与否参考X线以及CT等影像学检查判断，在行组织学评估时可见动物模型中出现了ALI时上皮细胞及内皮细胞病理变化特征，同时伴随出现了不同程度的炎症表现。建模30 min后向生理盐水组兔腹腔内注射NaCl 10 mL/kg，分别向低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组兔腹腔内注射XBJ 10、20、30 mg/kg，正常对照组和ALI模型组不做处理。

1.3.3 标本采集和处理 建模后12 h，用10%水合氯醛对六组兔进行腹腔麻醉，剂量为400 mg/kg。将麻醉后的兔仰卧，四肢及头部固定于操作台上，用手术刀切开胸腔，放血致兔死亡。用剪刀沿两侧腋中线向上至下颌部剖开，掀开胸前壁，暴露出兔的气管和肺脏，分离左肺上叶，用剪刀剪下，浸入10%福尔马林溶液中，存储在0℃低温中保存，并做好标记。

1.3.4 测定兔肺组织中NF-κB的含量 采用免疫印迹（Western blot）测定兔肺组织中NF-κB的含量。实验过程采用的Western blot每组重复3次，条带使用Quantity one灰度分析软件实施精密分析。

1.3.5 病理學检查 采用10%甲醛溶液对兔的左上肺组织进行固定、石蜡包埋、切片，再行HE染色，在光镜下对肺组织进行病理学检查，并及时记录其病理变化情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔肺组织光学显微镜下病理学变化情况

正常对照组（图1A）肺组织中肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液，肺间隙、肺毛细血管均显示正常的形态学解剖。ALI模型组（图1B）、生理盐水组（图1C）肺泡结构模糊，肺泡壁断裂，肺内大量炎症细胞浸润，肺组织间质及肺泡腔出现明显水肿，可见较多的红细胞，肺泡壁间质增厚，透明膜形成；低剂量XBJ治疗组（图1D）、中剂量XBJ治疗组（图1E）、高剂量XBJ治疗组（图1F）兔肺组织与正常对照组比较，肺内炎症细胞浸润减轻，肺组织间质及肺泡腔轻中度水肿，可见少量渗液、出血，其中中剂量XBJ治疗组损伤程度最轻，肺组织病理改变接近正常对照组，仅见少部分肺间质及肺泡壁轻度水肿及少量炎症细胞浸润。

2.2 Western blot验证结果

各实验组肺组织β-actin与NF-κB灰度比较，见图2～3。由图2可见，正常对照组β-actin灰度最高，但与ALI模型组及生理盐水组相比并未呈现出明显的差别，从低剂量XBJ组开始，至中剂量XBJ治疗组及高剂量XBJ治疗组，β-actin灰度减少。图3可见，正常对照组NF-κB灰度最低，ALI模型组及生理盐水组的NF-κB灰度呈现出较高的水平，但在使用了XBJ后，随着剂量的增加，NF-κB灰度逐渐减少。

2.3 各组兔肺组织NF-κB变化比较

ALI模型组、生理盐水组、低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组与正常对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；低剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组与ALI模型组、生理盐水组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；中剂量XBJ治疗组、与低剂量XBJ治疗组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；中剂量XBJ治疗组与高剂量XBJ治疗组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

注：与正常对照组比较，aP < 0.01；与ALI模型组、生理盐水组比较，bP < 0.01；与低剂量XBJ治疗组比较，cP < 0.05；与中剂量XBJ治疗组比较，dP < 0.01；ALI：急性肺损伤；XBJ：血必净；NF-κB：核因子-κBendprint

3 讨论

ALI是各种肺内和/或肺外致病因素导致的急性弥漫性炎症性肺损伤，ARDS是ALI进一步恶化的结果，表现为急性呼吸窘迫综合征和急性呼吸衰竭。ALI/ARDS病因多样，如严重感染、休克、创伤及烧伤等导致肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，引起急性呼吸窘迫和呼吸衰竭，其发病机制错综复杂。有研究表明，在ALI/ARDS病情的发生发展中，细胞因子和炎性介质的调控失衡起着十分关键的作用[3-4]。体内各脏器和肺内的肺上皮细胞、内皮细胞以及巨噬细胞等释放的白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、细胞间黏附因子1、粒巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子参与了ALI的发生、发展，这些细胞因子构成了肺内炎性反应的细胞因子网络[5-6]。NF-κB是参与炎性反应的一个重要信号转导分子，能调节与免疫及炎症相关促炎介质的基因转录与表达。当机体遭受致病因素损伤后，细胞受到脂多糖、TNF-α等信号刺激后，NF-κB被激活，活化的NF-κB迅速移位到细胞核与靶基因的特异序列相结合，启动信号通路和基因转录，诱导相关基因表达[7-10]。由此可见，ALI的发病机制涉及大部分细胞因子的表达调控，包括NF-κB的活化。本研究对兔的肺组织经Western blot分析，ALI模型组NF-κB活性明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），提示NF-κB参与了兔ALI的发病过程，且NF-κB的活化可能是构成肺内炎性反应的细胞因子网络一个中心环节。

现代战争常使用火器或者各种燃烧物质作为武器，导致人体ALI非常常见，且火器导致ALI有其自身的特征[11-13]。本研究中，由病理图片可见，正常对照组实验动物，显示正常健康兔的肺解剖组织，其肺泡壁、肺泡腔、肺间隙、肺毛细血管均显示正常的形态学解剖，ALI模型组实验兔其肺泡壁断裂，肺泡腔融合变大，肺间质增宽，肺毛细胞血管明显充血、水肿，大量的炎症细胞浸润，透明膜形成，提示肺组织结构已严重受损。故本课题成功制作了野战状态火器伤致ALI的实验动物模型，并提示火器伤引起的ALI是直接对肺组织的损伤，可瞬间引起肺泡廣泛断裂、肺间质明显水肿，肺组织结构受损严重，导致急性气体交换功能障碍，表现出严重的呼吸困难和呼吸窘迫等临床症状。

XBJ注射液是红花、赤芍、川芎、丹参、当归等中药材的提取物，主要成分为红花黄色素A等，其中红花、赤芍、丹参等具有活血化瘀功效，赤芍还能有效抑制急性炎症引起的渗出，促进炎症吸收等[14-16]；丹参能明显改善微循环，促进组织修复与再生，对过度增生的纤维母细胞有抑制作用[17-19]；当归具有活血、调节机体免疫功能、抑菌、抗动脉硬化和抗缺氧等功效[20]。XBJ注射液具有拮抗内毒素、调节免疫功能、拮抗炎性因子、改善微环循、保护内皮细胞等作用[21-22]，临床上可应用于急性化脓性扁桃体炎、化脓性支气管炎、细支气管炎、肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、腹腔内感染引起的全身炎症反应综合征及因感染、创伤、烧伤等引起的多器官功能障碍综合征等。一项XBJ治疗脓毒症及多器官功能障碍综合征的前瞻性多中心的临床研究表明XBJ具有控制炎性损伤的作用，其作用机制可能与调节促炎因子与抗炎因子的平衡、抑制中性粒细胞在肺组织中的渗出和炎症介质的过度表达有关[23]。本研究对火器致兔ALI模型进行XBJ干预治疗，发现低、中、高剂量XBJ治疗组兔肺组织中NF-κB活性明显降低，分别与ALI模型组、生理盐水组相比均有统计学差异（P < 0.05），提示XBJ对ALI具有保护作用，生理盐水没有这种保护作用。低、中、高剂量XBJ治疗组兔肺组织中NF-κβ活性以中剂量XBJ治疗组降低最明显，低剂量XBJ治疗组与中剂量XBJ治疗组、中剂量XBJ治疗组与高剂量XBJ治疗组比较均有显著差异（P < 0.05），但低剂量XBJ治疗组与高剂量XBJ治疗组结果比较，无统计学差异（P > 0.05）。从病理上观察，ALI模型组、生理盐水组、低剂量XBJ治疗组、高剂量XBJ治疗组兔肺组织与正常对照组比较，其肺泡壁、肺泡腔、肺间隙、肺毛细血管均发生明显的病理变化，中剂量XBJ治疗组肺泡壁毛细血管轻度充血，肺间质及肺泡壁轻度水肿，可见少量炎症细胞浸润。

综上所述，XBJ对ALI具有保护作用，在一定范围内，XBJ对ALI的保护效果是随着剂量增加而增强，且中等剂量XBJ对肺组织的保护作用效果最好，但超过中等剂量的XBJ对肺组织的保护作用则减弱。

[参考文献]

[1] 刘佳，朱余兵.血必净对脓毒症急性肺损伤大鼠氧化应激及炎性因子表达的影响[J].现代中药研究与实践，2016， 30（1）：33-35.

[2] 常月进，吴升，郝建，等.不同剂量乌司他丁对高温气体致兔急性肺损伤的影响[J].临床肺科杂志，2011，17（5）：781-783.

[3] 李成恩，李树雯，郝建，等.乌司他丁对爆炸致家兔急性肺损伤的治疗效果及初步机制研究[J].中国新药杂志，2016，25（19）：2250-2254.

[4] 黄敏坚，张远新，李平.血必净对油酸型急性肺损伤家兔血清炎症因子与肺水转运的影响[J].中国医学创新，2012， 9（18）：20-21.

[5] Cheng Z，Li L. Ginsenoside Rg3 ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice through inactivating the nuclear factor-κB（NF-κB）signaling pathway [J]. Int Immunopharmacol，2016，34：53-59.

[6] Angus DC，van der Poll T. Severe sepsis and septic shock [J]. New Engl J Med，2013，369（9）：840-851.endprint

[7] Huang WC，Lai CL，Liang YT，et al. Phloretin attenuates LPS-induced acute lung injury in mice via modulation of the NF-κB and MAPK pathways [J]. Int Immunopharmacol，2016，40：98-105.

[8] Korompelis P，Piperi C，Adamopoulos C，et al. Expression of vascular endothelial factor-A，gelatinases（MMP-2，MMP-9）and TIMP-1 in uterine leiomyomas [J]. Clin Chem Lab Med，2015，53（9）：1415-1424.

[9] Cheng DS，Han W，Chen SM，et al. Airway epithelium controls lung inflammation and injury through the NF-κB pathway [J]. J Immunol，2007，178（10）：6504-6513.

[10] 齊晓林，吴升，黄奕江，等.血必净治疗爆炸致兔ALI及细胞因子调节作用的实验研究[J].临床肺科杂志，2016， 21（10）：1824-1827.

[11] 潘蔚，刘军生，刘润生，等.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征致肺水肿的病理生理研究进展[J].解放军预防医学杂志，2016，34（4）：576-579.

[12] Fang Y，Xu P，Gu C，et al. Ulinastatin improves pulmonary function in severe burn-induced acute lung injury by attenuating inflammatory response [J]. J Trauma，2011，71（5）：1297-1304.

[13] 赵容顺，单浩洪，吴伟鸿.血必净对急性肺损伤兔核因子-κB活性变化的研究[J].临床和实验医学杂志，2013， 12（15）：1179-1181.

[14] 江庆，吴升，郝建，等.血必净注射液治疗AECOPD患者对血管内皮舒缩功能的影响[J].临床肺科杂志，2014， 19（7）：1169-1172.

[15] 余小云.血必净治疗缺血性脑卒中伴重症肺炎临床研究[J].中国现代医生，2016，54（29）：98-100.

[16] Wang P，Song YL，Liu Z，et al. Xuebijing injection in the treatment of severe pneumonia：study protocol for a randomized controlled trial [J]. Trials，2016，17（1）：1-11.

[17] 郭磊，刘龙丁，梅俊杰，等.酸吸入性肺损伤小鼠模型的建立[J].中国实验动物学报，2015，23（4）：347-352.

[18] 连向阳，古纪欢，王金宝，等.血必净注射液对改善严重多发伤患者预后作用的研究[J].中国医学创新，2017， 14（7）：77-81.

[19] 高洁，孔令博，刘斯，等.血必净注射液治疗脓毒症及多器官功能障碍综合征的前瞻性多中心临床研究[J].中华危重病急救医学，2015，27（6）：465-470.

[20] 闫龙，来毅.痰热清注射液对急性肺损伤大鼠的肺组织核因子-κB表达的影响[J].中国中医急症，2015，24（1）：34-35.

[21] 杨虎.不同剂量血必净注射液对脓毒症患者血清炎症介质水平的影响[J].现代医院，2016，16（10）：1450-1451.

[22] 刘子宸，吴棣，王刚，等.金纳多注射液对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织中核因子-κB表达的影响[J].安徽医药，2015，19（12）：2288-2289.

[23] 罗晓红，牛小娟，许瑞元，等.血必净治疗高原多器官功能障碍综合征猪模型的疗效及治疗前后肺组织中NF-κB mRNA的表达变化[J].中国急救医学，2015，35（8）：123-124.

（收稿日期：2017-08-04 本文编辑：张瑜杰）endprint