8种抗真菌药物对浅表真菌病致病菌株体外敏感性检测

吴伟伟 王千 龚杰 万喆 王爱平 李若瑜

(1.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.海南省皮肤病医院，海口 570206)

·论著·

8种抗真菌药物对浅表真菌病致病菌株体外敏感性检测

吴伟伟1,2王千1龚杰1万喆1王爱平1李若瑜1

(1.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.海南省皮肤病医院，海口 570206)

目的确定8种抗真菌药物对100株浅表致病真菌的体外药物敏感性。方法参考美国临床和实验室标准化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)微量液基稀释法M27-A3和M38-A2方案，采用8种抗真菌药物对100株常见浅表致病真菌进行体外药物敏感性测定。结果体外药敏实验结果显示，8种药物对皮肤癣菌表现出良好的体外药物敏感性，其中特比萘芬 (GM MIC，0.011 μg/mL，MIC范围,0.004～0.06 μg/mL)具有最强的抗真菌活性。咪康唑 (GM MIC，0.147 μg/mL，MIC范围0.015～1 μg/mL)具有最强的抗念珠菌活性。酮康唑 (GM MIC，0.097 μg/mL，MIC范围0.03～1 μg/mL)则对马拉色菌具有最佳体外抗真菌效果。结论体外药敏实验结果表明常见浅表致病真菌对8种常用抗真菌药物表现出不同的敏感性。酮康唑具有广谱高效的特点，对临床常见皮肤癣菌、念珠菌、马拉色菌均具有良好的体外抗真菌活性。特比萘芬和萘替芬对皮肤癣菌具有最佳的抗真菌活性。

抗真菌剂；药敏实验；微量液基稀释法；浅表真菌病

皮肤癣菌、念珠菌及马拉色菌感染性疾病目前仍然是浅部真菌病的主要致病菌。外用抗真菌药物已被临床广泛使用多年，因此有必要采用最新方法进行再评价。目前为止，美国临床和实验室标准化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)于2008年更新的针对丝状真菌和酵母菌的微量液基稀释法 (M38-A2[1]和M27-A3[2]方案)，因具有良好的准确性和重复性而获得广泛认可和应用。本研究采用酮康唑等8种常用抗真菌药物对100株分离自浅部真菌病患者的致病菌株 (皮肤癣菌、念珠菌及马拉色菌)进行体外抗真菌药物敏感性测定，以确定8种药物的抗真菌活性及临床应用多年后抗菌活性变迁情况。

1 材料和方法

1.1 受试菌株

100株受试真菌系北京大学真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分离自临床浅部真菌病患者，其中包括皮肤癣菌属45株 (红色毛癣菌20株，趾间毛癣菌10株，絮状表皮癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌各5株)，念珠菌属40株 (白念珠菌25株，光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌各5株)，马拉色菌属15株 (糠秕马拉色菌12株，厚皮马拉色菌3株)，均经形态学和核糖体内转录间隔区 (ribosomalinternal transcribed spacer (ITS) region)序列分析鉴定。质控菌株为美国菌种保藏中心提供的近平滑念珠菌ATCC-22019和须癣毛癣菌ATCC-MYA-4439。

1.2 试验方法

抗真菌药物 酮康唑、咪康唑、联苯苄唑、卢立康唑、环吡酮胺、阿莫罗芬、特比萘芬和萘替芬，均为标准试剂级粉剂。酮康唑、环吡酮胺和盐酸阿莫罗芬购自Sigma-Aldrich公司 (St.Louis,USA，批号分别为SLBK7327V，SLBF8062V，032M4704V)，硝酸咪康唑、联苯苄唑、盐酸特比萘芬和盐酸萘替芬购自中国食品药品检定研究院 (北京，中国，批号分别为100213-201406，100326-200201，100563-201402，100823-20501)，卢立康唑购自海格生物科技 (上海)有限公司 (上海，中国，批号为1407202)。采用100%二甲基亚砜 (DMSO)溶解稀释8种抗真菌药物至储存液浓度为1.6 mg/mL，置于无菌聚乙烯小瓶-70℃存储备用。

药物稀释 根据CLSI M38-A2或CLSI M27-A3方案进行。对皮肤癣菌和念珠菌使用RPMI-1640液体培养基将8种药物储存液进行2倍比稀释，对马拉色菌使用改良LAN液体培养基[3-4]将8种药物储存液进行2倍比稀释。体外药敏测定中，最终浓度范围在皮肤癣菌时为酮康唑、咪康唑、联苯苄唑、环吡酮胺、阿莫罗芬0.015～8 μg/mL，卢立康唑0.001～0.5 μg/mL、特比萘芬和萘替芬0.000 25～0.125 μg/mL；在念珠菌时8种药物均为0.015～8 μg/mL；在马拉色菌时8种药物均为0.03～16 μg/mL。

菌悬液制备 根据CLSI M38-A2或CLSI M27-A3方案，利用血细胞计数器制备菌悬液，并调整皮肤癣菌菌悬液终浓度为1～3×103CFU/mL，念珠菌和马拉色菌菌悬液终浓度为0.5～2.5×103CFU/mL。

体外药敏试验 体外药敏试验根据CLSI M38-A2或M27-A3方案进行。接种后的药敏板置于湿盒内，皮肤癣菌、念珠菌和马拉色菌分别在35℃培养5～7 d、48 h和72 h。每天观察生长情况，以阳性对照孔生长良好为准。

MIC判定 最小抑菌浓度 ( minimal inhibitory concentrations，MIC)值采用终点判读法进行结果判读。针对皮肤癣菌，环吡酮胺、阿莫罗芬、特比萘芬或萘替芬MIC判读标准为与生长对照相比无任何肉眼可辨生长 (100%)的最低药物浓度；唑类药物MIC判读标准为与生长对照相比生长明显抑制 (80%)的最低药物浓度。针对念珠菌和马拉色菌，8种药物MIC判读标准为与生长对照相比生长明显抑制 (80%)的最低药物浓度。

1.3 统计学分析与处理

对所有试验菌株记录药物MIC值，计算MIC范围，MIC50、MIC90和MIC几何均数 (geometric mean MIC，GM MIC)。

2 结 果

8种药物对100株浅表致病真菌体外药物敏感性模式 (见表1)。体外药敏实验结果显示8种抗真菌药物对100株浅表致病真菌表现出不同的抗真菌活性。8种药物针对45株皮肤癣菌的GM MIC由低至高分别为特比萘芬 (0.011 μg/mL)，萘替芬 (0.016 μg/mL)，阿莫罗芬 (0.028 μg/mL)，卢立康唑 (0.034 μg/mL)，咪康唑 (0.093 μg/mL)，联苯苄唑 (0.111 μg/mL)，酮康唑 (0.161 μg/mL)，环吡酮胺 (1.131 μg/mL)。8种抗真菌药物针对40株念珠菌的GM MIC由低到高分别为咪康唑 (0.147 μg/mL)，酮康唑 (0.202 μg/mL)，联苯苄唑 (0.765 μg/mL)，环吡酮胺 (1.0 μg/mL)，阿莫罗芬 (2.834 μg/mL)，卢立康唑 (4.362 μg/mL)，特比萘芬 (9.849 μg/mL)，萘替芬(12.553 μg/mL)。8种药物针对马拉色菌的GM MIC由低到高分别为酮康唑 (0.097 μg/mL)，阿莫罗芬 (0.871 μg/mL)，联苯苄唑 (1.260 μg/mL)，环吡酮胺 (4.0 μg/mL)，咪康唑 (9.190 μg/mL)，卢立康唑 (30.555 μg/mL)，特比萘芬 (42.224 μg/mL)，萘替芬 (44.221 μg/mL)。

表1 8种抗真菌药物对100株分离自浅部真菌病患者的致病真菌体外抗真菌活性 (μg/mL)

Species(Numberofstraintested)KetoconazoleMiconazoleBifonazoleLuliconazoleCiclopiroxOlamineAmorolfineTerbinafineNaftifineMIC500．1250．251>810．12524MIC900．1250．54>810．528AllCandidaRange0．03⁃80．015⁃10．125⁃40．5⁃>810．015⁃>81⁃>82⁃>8isolatesGM0．2020．1470．7654．36212．8349．84912．553(n=40)MIC500．1250．251418>8>8MIC9010．52>81>8>8>8M．furfurRange0．06⁃12⁃>160．25⁃16>1640．25⁃4>32≥32(n=12)GM0．13010．6791．4143240．7076460．408MIC500．12581>1640．5>32>32MIC900．25>164>1644>32>32M．pachydermatisRange0．034⁃80．5⁃1≥16421⁃322⁃>32(n=3)GM0．035．0400．79425．39842812．699MIC500．0341>16421616MIC900．0381>164232>32AllMalasseziaRange0．03⁃12⁃>160．25⁃16≥1640．25⁃41⁃>322⁃>32isolatesGM0．0979．1901．26030．55540．87142．22444．221(n=15)MIC500．0681>1640．5>32>32MIC900．25>164>1644>32>32

注：1).GM.geometric mean,2) and 3).MIC50and MIC90,MIC required to inhibit the growth of 50% and 90% of the test strains

3 讨 论

本实验研究结果显示8种药物均对45株皮肤癣菌表现出良好的体外药物敏感性，同既往部分研究结果相似[5-6]。Adimi等[7]报道酮康唑、特比萘芬、萘替芬、环吡酮胺和阿莫罗芬对五种皮肤癣菌的MIC值普遍高于本研究中相应结果，但却表现出相似的药物敏感性模式，特比萘芬和萘替芬对皮肤癣菌具有最佳的体外抗真菌活性。本研究结果显示唑类药物抗念珠菌活性要高于其他种类药物。Jo Siu等[8]的研究结果表现出相似的药物敏感性模式，即唑类药物最为敏感，丙烯胺类药物敏感性最低，环吡酮胺和阿莫罗芬居中。尽管本研究中8种药物对马拉色菌MIC同国内外多项研究结果不尽一致[9-11]，但本研究发现酮康唑对马拉色菌具有最佳抗菌活性，同Rojas[12]和Carrillo-Muoz[13]的研究结果一致，因此酮康唑应当作为马拉色菌感染性疾病治疗的良好选择。

综上所述，本研究结果表明常见浅表致病真菌对8种常用抗真菌药物表现出不同的敏感性。尽管酮康唑已经临床使用多年，但仍然具有广谱高效的特点，对于常见皮肤癣菌、念珠菌、马拉色菌具有良好的体外抗真菌活性。特比萘芬和萘替芬对皮肤癣菌具有最佳体外抗真菌活性。上述研究结果可为日渐增加的浅表真菌病治疗提供药物选择参考。

致谢 本研究由西安杨森制药有限公司科学研究基金资助。

[1] Clinical and Laboratory Standards Institute Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi;Approved standard-2nd Ed.CLSI document M38-A2[S].Wayne PA:.Clinical Laboratory Standards Institute.2008.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved standard-3rd Ed.CLSI document M27-A3[S].Wayne PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

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Invitrosusceptibilitytestingofeightantifungalagentsagainstpathogenicfungiisolatedfromsuperficialmycoses

WU Wei-wei1,2,WANG Qian1,GONG Jie1,WAN Zhe1,WANG Ai-ping1,LI Ruo-yu1

(1.DepartmentofDermatologyandVenereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,PekingUniversity,Beijing100034,China；2.DepartmentofDermatologyandVenereology,HainanProvinicalHospitalofSkinDisease，Haikou570206,China)

ObjectiveTo investigate theinvitroactivity of 8 antifungal agents against 100 strains of pathogenic fungi isolated from patitens with superficial mycoses.MethodsThe antifungal susceptibility testing was investigated following Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) reference broth microdilution methods.Eight antifungal agents were evaluated against 45 dermatophyte strains,35Candidastrains and 15Malasseziastrains.ResultsOur minimum inhibitory concentration (MIC) results revealed that terbinafine (GM MIC,0.011 μg/mL;MIC range,0.004-0.06 μg/mL) had the strongest antifungal activity againstDermatophyte,miconazole (GM MIC,0.147 μg/mL;MIC range,0.015-1 μg/mL) againstCandida,and ketoconazole (GM MIC,0.097 μg/mL;MIC range,0.03-1 μg/mL) againstMalassezia.ConclusionsTheinvitrosusceptibility testing indicates that common superficial pathogenic fungi exhibit variable susceptibilities to 8 antifungal agents.Ketoconazole has a potent antifungal activity for dermatophyte,CandidaandMalassezia.Terbinafine and naftifine were the most active agents forDermatophyte.

antifungal agents;susceptibility testing;broth microdilution;superficial mycoses

[Chin J Mycol，2017，12(5):279-282]

R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0279-04

吴伟伟，男 (汉族)，博士，副主任医师.E-mail:vigorwu@bjmu.edu.cn

李若瑜,E-mail:mycolab@126.com

2017-03-04

[本文编辑] 施 慧